Universität zu Köln

Tschirka, Julia (2020). Transporter-Tandems zur Bestimmung der relativen Transporteffizienz von membranständigen Transportproteinen – Konstruktion und Validierung. Thesis Abstract, Universität zu Köln.

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Abstract

Die Membrantransporter spielen eine zentrale Rolle in der Zellhomöostase und ihre Charakterisierung repräsentiert einen essentiellen Schritt in der Medikamentenentwicklung. Die Transporter-Tandems sind die Grundlage für eine neue Methode zur Messung der relativen Transporteffizienz (TE) von membranständigen Transportproteinen in vitro. Ein Tandem-Heterodimer besteht aus einem „Ziel“- und einem „Referenz“-Transporter, die mit Hilfe eines Linkers miteinander verknüpft werden. Die Aktivität des Ziel-Transporters wird auf die Aktivität des Referenz-Transporters normiert. Im Gegensatz zu anderen existierenden Methoden für die Normierung der Transportaktivität, die keine Unterscheidung zwischen aktiven und nicht aktiven Transportern gewährleisten, wie z.B. Membranisolierung und die darauffolgende absolute Proteinquantifizierung, erfasst das Tandem-System nur die aktiven Transporter in der Plasmamembran. Zur Etablierung des Tandem-Systems wurde ein Tandem-Heterodimer aus zwei Transportern der SLC22-Familie, dem Ergothioneintransporter (ETT, SLC22A4) und dem organischen Kationen-Transporter 2 (OCT2, SLC22A5), generiert. Als Linker wurden vier kurze Peptide (G10, (GASG)2, (GAAAK)2 und (GP)5) verwendet. Die ETT-OCT2-Tandems wurden kinetisch mit den Substraten Ergothionein (ET) bzw. 1-Methyl-4-Phenylpyridinium (MPP+) untersucht. Die Tandem-Heterodimere, die keinen Linker oder einen G10-Linker aufwiesen, zeigten keine Aktivität; Tandem-Konstrukte, die die Linker (GASG)2, (GAAAK)2 und (GP)5 enthielten, waren dagegen funktionsfähig. Die Parameter der Transporter-Substrat-Interaktion für ETT und OCT2, i.e. Km = 32-50 µM (ETT) bzw. Km = 3-4 µM (OCT2) und Vmax = 460 800 pmol×mg 1×min-1 (ETT) bzw. Vmax = 390-500 pmol×mg-1×min-1 (OCT2), waren im Vergleich zu den entsprechenden Parametern der monomeren Transporter leicht verändert. Das Tandem-Heterodimer ETT-(GASG)2-OCT2 erwies sich als das optimalste Konstrukt der untersuchten Serie und wurde daher in weiterführenden Experimenten verwendet. Die Verifizierung der Stöchiometrie im ETT-(GASG)2-OCT2-Konstrukt erfolgte mittels absoluter Proteinquantifizierung (AQUA). Zur Solubilisierung und Aufarbeitung der Membranproteine wurden vier verschiedene Puffer und zwei Extraktionsmethoden eingesetzt. Die optimale Ausbeute von 100 fmol für alle Peptide und ein ETT:OCT2-Verhältnis von 0,9:1 und 0,7:1 wurde unter dem Einsatz von 2 % SDC-Puffer und Single-Pot Solid-Phase-enhanced Sample Preparation (SP3)-Extraktion erreicht. Anschließend wurden die Transporter-Tandems ETT-(GASG)2-OCT2 und ETT-L503F-(GASG)2-OCT2 zur Bestimmung der relativen TE der „Ziel“-Transporter ETT wt und der Mutante ETT-L503F, die mit chronischen Autoimmunerkrankungen wie Rheumatoide Arth-ritis assoziiert ist, generiert. Die ETT-L503F-Mutante wies im Vergleich zu ETT wt eine 4-fach höhere TE für den Transport des Substrates ET auf. Die vorliegende Arbeit präsentiert den ersten Schritt in der Entwicklung eines Transporter-Tandem-Systems zur Bestimmung der relativen TE. Die Analyse weiterer Transporter-Heterodimere zur Identifizierung von optimalen „Referenz“-Transportern und Linkern ist jedoch für eine Verifizierung der Methode unerlässlich. Ein optimiertes Transporter-Tandem-System könnte zukünftig zur Bestimmung der relativen TE von Transportern und zu ihrer Klassifizierung ohne Membranisolierung und Proteinquantifizierung in vitro verwendet werden, um die Medikamentenentwicklung zu beschleunigen.

Item Type:	Thesis Abstract
Translated title:	Title Language Transporter-tandems as a tool for determination of the relative transport efficiency of membrane transport proteins – construction and validation English
Translated abstract:	Abstract Language Membrane transporters play a key role in the cell homeostasis and their characterization is essential for drug development. Transporter tandems are the basis for a new method to measure the relative transport efficiency (TE) of membrane transport proteins in vitro. A heterodimeric tandem consists of a "target" transporter and a "reference" transporters, which are connected by a short peptide linker. The activity of the target transporter is then related to the activity of the reference transporter. In comparison to existing scaling methods for transporter activity, which do not distinguish between active and non-active transporters, such as membrane isolation followed by absolute protein quantification, the tandem system only analyses the active transporters in the membrane. To establish the tandem system, a tandem heterodimer consisting of two transporters from the SLC22 family i.e. the ergothioneine transporter (ETT, SLC22A4) and the organic cation transporter 2 (OCT2, SLC22A5), was generated. Four different peptides (G10, (GASG)2, (GAAAK)2 und (GP)5) were used as linkers. The kinetics of ETT-OCT2 tandems was analysed using the substrates ergothioneine (ET) and 1-methyl-4-phenylpyridinium (MPP+), respectively. The tandems without any linker and with a G10 linker were not active. However, the tandems carrying the linkers (GASG)2, (GAAAK)2 and (GP)5 proved to be functional with slightly different kinetic parameters in comparison to monomeric transporters. The values of Km for ETT and OCT2 were 23-56 and 3-5 µM, respectively, whereas the respective values of Vmax were 460-800 and 390-500 pmol×mg 1×min-1, respectively. The tandem construct with ETT-(GASG)2-OCT2 showed the most optimal kinetic results of the investigated series and, thus, was used for further experiments. The stoichiometry in the ETT-(GASG)2-OCT2 tandem was verified by absolute protein quantification (AQUA) using four different buffers and two sample preparation protocols were used. The most optimal peptide yield of around 100 fmol for all peptides and ETT:OCT2 stoichiometry of 0,9:1 und 0,7:1 were found for samples solubilized in 2 % SDC buffer and processed according to the Single-Pot Solid-Phase-enhanced Sample Preparation (SP3) protocol. Subsequently, the tandems ETT-(GASG)2-OCT2 und ETT-L503F-(GASG)2-OCT2 were gen-erated to determine the relative TE of the “target” transporters ETT wt and the mutant ETT-L503F, that is associated with chronic autoimmune diseases like Rheumatoid arthritis. Compared to ETT wt, the ETT-L503F mutant exhibited a 4-fold higher TE for the transport of the substrate ET. This study represents the first step in the development of a transporter tandem system to determine the relative TE. However, the analysis of further transporter tandems to identify optimal “reference” transporters and linkers is required for verification of the method. An optimized transporter tandem system might be used in the future to determine the relative TE of transporters and to for their classification, thus facilitating the process of drug development, rendering membrane isolation and absolute protein quantification unnecessary. English
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Tschirka, Julia UNSPECIFIED UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-121315
Date:	September 2020
Language:	German
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Medicine > Pharmakologie > Instítut für Pharmakologie
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Membrane transporters, Transport Efficiency,Proteomics, Transporter Tandems, Peptide-Linker, AQUA, ETT, OCT2, ETT-L503F, ETT-G462E English Membrantransporter, Transporteffizienz, Transporter-Tandems, ETT, OCT2, Peptidlinker, AQUA, ETT-L503F, ETT-G462E German
Date of oral exam:	14 August 2020
Referee:	Name Academic Title Schwarz, Günter Prof. Dr. Krüger, Marcus Prof. Dr. Herzig, Stefan Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/12131