Charakterisierung der Rolle zellulärer Proteine bei der Transkription und Replikation von Papillomviren

Rehtanz, Manuela (2004). Charakterisierung der Rolle zellulärer Proteine bei der Transkription und Replikation von Papillomviren. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

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Abstract

Papillomviren (PV) infizieren die Basalzellen der Haut oder Schleimhaut und induzieren die Bildung gutartiger Tumoren, die abhängig vom infizierenden PV-Typ maligne entarten können. Das virale E2 Protein spielt eine essentielle Rolle bei der Regulation des viralen Lebenszyklus. Es kann die virale Genexpression sowohl aktivieren als auch reprimieren und erfüllt gemeinsam mit dem PV E1 Protein Funktionen bei der effizienten Aktivierung der viralen Replikation. Innerhalb dieser Studie wurden Wechselwirkungen des E2 Proteins mit zellulären Proteinen, die für die Aktivierung der Transkription wichtig sind, untersucht. In Vorarbeiten konnte mit Hilfe eines Yeast two-Hybrid Systems das humane Nucleosome Assembly Protein 1 (hNAP-1), ein Histon Chaperon, als Interaktionspartner der Aktivierungsdomäne des Transkriptionsaktivators BPV1 E2 (Bovine PV1 E2) identifiziert werden. Diese Interaktion wurde in vitro in GST pull-down Experimenten mit den E2 Proteinen von BPV1, HPV8 (Human PV8) und HPV18 bestätigt. Ziel dieser Arbeit war, die Bedeutung der Interaktion von E2 mit hNAP-1 für E2-spezifische Funktionen zu charakterisieren. Die Wechselwirkung von hNAP-1 mit diesen drei E2 Proteinen konnte in vivo durch Koimmunpräzipitationen bestätigt werden. Zusätzlich wurde gezeigt, dass die Interaktion direkt ist und nicht nur durch den zellulären Koaktivator p300, der E2 und hNAP-1 bindet, vermittelt wird. Durch die Koexpression von hNAP-1 wurde die E2-vermittelte Aktivierung der Transkription stark stimuliert, was auf eine Rolle dieser Wechselwirkung für die E2-spezifische Aktivator-Funktion hinweist. E2 bindet an zwei separate Regionen von hNAP-1, an eine innerhalb des C-Terminus und eine interne Region. Durch die Verwendung von hNAP-1 Deletionsmutanten wurde gefunden, dass die Interaktion von hNAP-1 mit E2 für die Kooperativität der beiden Proteine notwendig ist, dass jedoch überdies die N-terminalen 91 Aminosäuren von hNAP-1 für dessen Koaktivitor-Funktion essentiell sind. Überdies konnte hier zum ersten Mal die Existenz eines ternären Komplexes bestehend aus hNAP-1, E2 und p300 in vitro durch ein Kompetitionsexperiment und eine Glycerolgradientanalyse gezeigt werden. Dieser ternäre Komplex scheint sehr effizient zur Aktivierung der Transkription beizutragen, denn E2, hNAP-1 und p300 kooperierten bei der Aktivierung der HPV8 Genexpression. Somit könnten sowohl p300 als auch hNAP-1 durch E2 in Promotornähe rekrutiert werden, um die PV Genexpression effizient zu aktivieren. Weiterhin interagiert auch p53, das ebenfalls p300 als Koaktivator verwendet, direkt mit hNAP-1. Es konnte darüber hinaus gezeigt werden, dass auch diese Interaktion funktional ist, da hNAP-1 die p53-vermittelte Aktivierung der Genexpression stimulieren konnte. Dagegen band TEF-1, welches p300 nicht als Koaktivator verwendet, in vitro nicht an hNAP-1, und in Korrelation dazu war hNAP-1 auch nicht in der Lage, die TEF-1-vermittelte Aktivierung der Transkription zu stimulieren.

Item Type:

Thesis (PhD thesis)

Translated abstract:

Abstract

Language

Papillomaviruses (PV) infect the basal cells of the skin or mucosal epithelium thereby inducing benign tumors which may undergo malignant transformation dependent on the infecting PV type. The viral E2 protein plays an essential role within the regulation of the viral life cycle. It is able to activate or repress viral gene expression, and together with the PV E1 protein E2 fulfills functions in the activation of viral replication. In this study the role of the interaction of E2 with cellular proteins which are important for transcriptional activation were investigated. In previous experiments the human Nucleosome Assembly Protein 1 (hNAP-1), a histone chaperone, was identified as a protein interacting with the activation domain of the transcriptional activator BPV1 E2 (Bovine PV1 E2) by a yeast two-hybrid screen. This interaction was confirmed in vitro by GST pull-down experiments with the E2 proteins of BPV1, HPV8 (Human PV8) and HPV18. The aim of this study was to characterize the importance of the interaction of E2 and hNAP-1 for E2-specific functions. The binding of hNAP-1 to these three E2 proteins was confirmed in vivo by coimmunoprecipitations. In addition, it was shown that the interaction is direct and not merely mediated by the cellular coactivator p300, which is bound by E2 and hNAP-1. E2-mediated activation of transcription was strongly stimulated by coexpression of hNAP-1, indicating a role of this interaction for the activator function of E2. Two separable domains of hNAP-1 are bound by E2, one within the C-terminus and an internal domain. By using hNAP-1 deletion mutants it turned out, that the binding of hNAP-1 to E2 is necessary for the cooperativity between both factors but in addition, the N-terminal 91 amino acids of hNAP-1 also are crucial for its coactivator function. Moreover, for the first time evidence for the existance of a ternary complex consisting of hNAP-1, E2 and p300 in vitro was provided by a competition experiment and a glycerol gradient sedimentation. This ternary complex seems to be very efficient in activation of transcription since E2, hNAP-1 and p300 cooperated in activating HPV8 gene expression. Hence, p300 and hNAP-1 as well may be recruited to the DNA by E2 to efficiently activate PV gene expression. Furthermore, p53 which also uses p300 as a coactivator, directly interacts with hNAP-1. This interaction was also shown to be functional since hNAP-1 could enhance p53-mediated activation of gene expression. In contrast, TEF-1 which does not use p300 as a coactivator did not bind to hNAP-1 in vitro and in correlation hNAP-1 was not able to stimulate TEF-1-mediated activation of transcription.

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