Universität zu Köln

Shen, Qian-Hua (2004). Functional Analysis of Barley MLA-triggered Disease Resistance to the Powdery Mildew Pathogen. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

More than 30 race-specific resistance specificities to the powdery mildew fungus Blumeria graminis f. sp. hordei (Bgh) map to the barley Mla locus. This exceptionally polymorphic locus harbors multiple members of three distantly related gene families, each encoding homologs of intracellular disease resistance (R) proteins. Previously isolated Mla1 and Mla6 R genes to Bgh encode highly sequence-related proteins (>90% identity) of approximately 105 kD that contain an N-terminal coiled-coil (CC) structure, a central nucleotide binding (NB) site, a Leucine rich repeat (LRR) region, and a C-terminal non-LRR (CT) region. A subset of Mla R genes are known to require for their function Rar1 and Sgt1. Intracellular RAR1 and SGT1 are known to physically associate and are thought to have co-chaperone-like activity. It was hypothesized that other Mla R gene specificities might be closely related to Mla1 and Mla6. A cosmid library was constructed from an Mla12-containing barley line and cosmids containing candidate Mla12 genes were isolated using molecular probes derived from Mla1. Race-specific resistance activity to an AvrMla12 containing Bgh isolate was detected following transient single cell expression of the Mla12 candidate gene in detached barley leaves. This and the identification of point mutations in susceptible mla12 mutants demonstrated that the candidate gene is Mla12. Over-expression of Mla12 in the single cell assay shifted the slow Mla12 resistance response in wild type plants to a rapid Mla1/Mla6-like resistance, in effect terminating fungal growth at the cell wall penetration stage before haustorium development. This indicates that the cognate AvrMla12 product must be secreted before the switch from surface to invasive fungal growth. Resistance mediated by Mla12 over-expression retained the requirement for Rar1. Single cell dsRNAi gene silencing experiments revealed a requirement of Mla12 resistance for Sgt1. A series of reciprocal domains swaps between MLA1 and MLA6 identified in each protein regions required for the recognition of cognate Bgh effectors (encoded by AvrMla1 and AvrMla6). These regions comprise different but overlapping LRR regions and the CT part. This is consistent with the finding that the LRR and CT encoding parts of Mla1 and Mla6 exhibit evidence for diversifying selection. Unexpectedly, MLA chimeras that confer AvrMla6 recognition specificity exhibit markedly different dependence on Rar1. Furthermore, uncoupling of MLA6-specific resistance from RAR1 also uncoupled the resistance response from SGT1. These findings suggest that differences in the degree of RAR1 dependence of different MLA immune responses are determined by intrinsic properties of MLA variants and place RAR1/SGT1 activity downstream of and/or coincident with the action of presumptive resistance protein�containing recognition complexes. Previous analysis showed that loss-of-function mutations in both barley and Arabidopsis Rar1 severely impair accumulation of MLA and RPM1 NB-LRR proteins in healthy plants, respectively. In this study it was shown that co-expression of RAR1 and MLA1 or MLA6 in heterologous yeast is not sufficient to elevate MLA steady state levels. This suggests that RAR1 stabilizes MLA proteins indirectly, e.g. through other host factors that might be components of MLA containing recognition complex(es). Yeast 2-hybrid screenings were used to identify host proteins directly interacting with MLA R proteins. Several MLA interactors were identified using distinct or overlapping domains from MLA1 or MLA6 proteins. Amongst those is the SGT1 protein that is genetically required for the function of many NB-LRR proteins in diverse plant species. Other MLA interactors exhibit high sequence relatedness to carbonic anhydrase (CA), formin homology (FH) proteins, and a WRKY transcription factor. Interestingly, tobacco carbonic anhydrase was previously shown to be required for the activation of an efficient cell death response triggered upon race-specific recognition of the Pseudomonas syringae effector AVRPTO by the R gene Pto. The functional significance of the identified interactors for Mla-mediated race-specific resistance to Bgh remains to be validated, e.g. by dsRNAi experiments in the single cell gene expression assay.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language Funktionale Analyse der MLA-vermittelten Resistenz in Gerste gegen Mehltau German
Translated abstract:	Abstract Language In Gerste existieren über 30 rassespezifische Resistenz-Spezifitäten gegen den Gerstenmehltau Blumeria graminis f. sp. hordei, die dem Mla-Locus zugeordnet werden. An diesem außergewöhnlich polymorphen Locus befindet sich eine Vielzahl von Genen aus drei entfernt verwandten Familien, die Sequenzen mit hoher Homolgie zu bekannten Resistenzgenen (Resistance gene homologs RGH) beinhalten.. Bisher isolierte Mla-Gene kodieren für Proteine mit einem ungefähren Gewicht von 105 kD, die eine bemerkenswert hohe Ähnlichkeit in Struktur und Sequenz (über 90% identische Aminosäuren) zeigen. Die Proteine besitzen eine N-terminale coiled-coil-Struktur (CC), eine zentrale Nukleotidbindestelle (NB), eine Leucine-rich repeat-Region (LRR) und eine C-terminale nicht-LRR Region (CT). Ein Teil der Mla R-Gene benötigt Sgt1 und Rar1um zu funktionieren. Intrazelluläres SGT1 und RAR1 assoziieren physisch und haben möglicherweise eine co-chaperone-ähnliche Aktivität. Es wurde vermutet, dass andere Mla-Resistenzspezifitäten, zu den bisher bekannten, Mla1 und Mla6, eng verwandt sind. Eine Cosmidbibliothek, die von einer Mla12 enthaltenden Gerstelinie erstellt worden war, wurde verwendet, um mit Hilfe von molekularen Sonden von Mla1 Cosmide mit Kandidaten für Mla12 zu isolieren. Rassenspezifische Resistenzaktivität der Mla12-Kandidaten gegen AvrMla12-enthaltendes Bgh-Isolat wurde durch Überexpression mittels transienter Einzelzellgenexpression in abgetrennten Blättern festgestellt. So und durch die Identifikation von Punktmutationen in anfälligen mla12-Mutanten, wurde demonstriert, dass der Kandidat tatsächlich Mla12 ist. Überexpression von Mla12 mittels transienter Einzelzellgenexpression zeigte, dass die langsame Mla12-Immunantwort zu einer schnellen, Mla1/6-ähnlichen Resistenz umgewandelt werden kann und die Entwicklung des Pilzes vor der Ausbildung des Haustoriums, im Stadium der Zellwandpenetration gestoppt wird. Das deutet an, dass die Sekretion des korrespondierenden AvrMla12-Produkts vor dem �Umschalten von oberflächlichem zu invasivem Wachstum stattfinden muss. Resistenz, die durch Überexpression von Mla12 vermittelt wird, bleibt Rar1 abhängig. Eine Abhängigkeit der Mla12-Resistenz von Sgt1 wurde durch transiente dsRNAi-silencing-Versuche aufgedeckt. Eine Serie von wechselseitigen Domänenaustauschexperimenten zwischen MLA1 und MLA6 identifizierte in jedem Protein die Domäne, die für die Erkennung der zugehörigen Effektormoleküle aus Mehltau (kodiert von AvrMla1 und AvrMla6) notwendig ist. Diese Domänen lagen in verschiedenen, aber überlappenden Teilen der LRR- und der CT-Region. Das stimmt mit Hinweisen überein, dass diversifizierende Selektion in der LRR- und CT-Region angreift. MLA-Chimären, die die spezifische Erkennung von AVRMLA6 vermitteln, zeigten unerwarteterweise eine ausgesprochen unterschiedliche Abhängigkeit von Rar1. Darüber hinaus wurde durch Entkopplung der MLA6-spezifische Erkennung von RAR1 auch die Abhängigkeit von SGT1 entkoppelt. Diese Ergebnisse legen nahe, dass der unterschiedliche Grad der RAR1 Abhängigkeit verschiedener MLA-Resistenzen, eine intrinsische Eigenschaft der verschiedenen MLA-Varianten ist und platziert die Aktivität von RAR1/SGT1 hinter und/oder zusammen mit mutmaßlichen R-Protein enthaltenden Komplexen. Bisherige Studien haben gezeigt, dass Rar1 loss-of-function Mutanten von Gerste und Arabidopsis in der Akkumulierung von MLA1 beziehungsweise RPM1 NB-LRR Proteinen in gesunden Pflanzen in stark beeinträchtigt sind. In dieser Studie wurde gezeigt, dass die Co-Exprimierung von RAR1 und MLA1 oder MLA6 in Hefe nicht ausreicht, um stationäre Proteinmenge an MLA zu erhöhen. Dies lässt vermuten, dass RAR1 MLA Proteine indirekt stabilisiert, z.B. durch andere Wirtsfaktoren, die Teil eines/von MLA enthaltenden Erkennungskomplexes/n sein könnten. Yeast 2-Hybrid Screening wurde für die Identifizierung von potentiellen Wirtsfaktoren eingesetzt, die an der MLA-vermittelten Resistenz beteiligt sind. Mehrere potentielle MLA-Interaktoren wurden für einzelne oder überlappende Domänen von MLA1 oder MLA6 Proteinen identifiziert. Unter diesen Interaktoren ist das SGT1-Protein, das für die Funktion von vielen NB-LRR-Proteinen in verschiedenen Pflanzenarten notwendig ist, gefunden worden. Andere MLA-Interaktoren zeigen hohe Sequenzverwandschaft zu Carboanhydrase (CA), zu Proteinen mit Homologie zu Formin (FH), HvSGT1 und zu einem WRKY Transkriptionsfaktor. Interessanterweise wurde zuvor in Tabak gezeigt, dass Carboanhydrase für die Aktivierung einer effizienten Zelltodantwort nach rassespezifischer Erkennung des Pseudomonas syringae Effektors AVRPTO durch das R Gene Pto notwendig ist. Die funktionelle Signifikanz der identifizierten Interaktoren für die Mla-vermittelte rassenspezifische Resistenz gegen Bgh muss noch bestätigt werden, z.B. durch dsRNAi-Experimente mittels transienter Einzelzellgenexpression. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Shen, Qian-Hua shen@mpiz-koeln.mpg.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-12331
Date:	2004
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Außeruniversitäre Forschungseinrichtungen > MPI for Plant Breeding Research
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Resistenz gegen Pflanzenkrankheiten, Resistenzgene, Gerste, Mla, Mehltau German Plant disease resistance, Resistance genes, Barley, Mla, Powdery mildew English
Date of oral exam:	4 July 2004
Referee:	Name Academic Title Schulze-Lefert, Paul Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/1233