Universität zu Köln

Korte, Henning (2004). In vivo Funktion von CAP1. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Die Proteine der CAP Familie sind G-Aktin bindende Proteine, die bisher in allen untersuchten eukaryotischen Organismen identifiziert werden konnten. Das erste Mitglied dieser Familie wurde in S. cerevisiae als Bestandteil des Adenylatzyklasekomplexes entdeckt, später konnten CAP Homologe in einer Vielzahl von Pflanzen, Tieren und Pilzen identifiziert werden. In Säugetieren werden zwei Homolge, CAP1 und CAP2, exprimiert. Hier wurde ein Knockout-Vektor für CAP1 aus der Maus konstruiert und die Expression von CAP1 in verschiedenen Organen sowie dessen subzelluläre Lokalisierung untersucht. Die Arme des Knockout-Vektors wurden mit einer DNA-Polymerase mit Korrekturlesefunktion (PfuTurbo®-DNA-Polymerase) aus genomischer ES-Zell DNA amplifiziert und zusammen mit einer Neomycinresistenzkassette in einen pBS-Vektor ligiert. Die homologe Rekombination des Knockout-Konstruktes mit der genomischen Zielsequenz sollte das dritte Exon des CAP1 Gens, bis auf wenige Basen am 5´ und 3´ Ende des Exons gegen die Neomyzinresistenzkassette austauschen. Dadurch kommt es zu einer Leserasterverschiebung, die zu einem funktionslosen CAP1 Allel führt. Mögliche alternative Spleißvorgänge hätten ein verkürztes CAP1 Protein hervorbringen können, dem aber der N-Terminus gefehlt hätte. Nach der Transfektion der ES-Zellen mit dem knockout-Vektor wurden 450 ES-Zell Klone isoliert. Die Durchmusterung dieser Klone nach homologer Rekombination erbrachte bei Southernblot Analysen aber keine positiven Ergebnisse. In Westernblot Analysen von Gewebehomogenaten wurde hier die CAP1 Expression in der Maus untersucht. Dabei wurden in Homogenaten von Thymus, Milz und Lunge die größten Mengen detektiert. Die zweitgrößten Mengen wurden in Hoden, Leber und Magen nachgewiesen. Die geringsten CAP1 Spiegel waren in Herz, Skelettmuskel, Gehirn, Haut und Niere vorhanden. Genauer wurde die Expression für CAP1 im Gehirn untersucht. Bei neugeborenen Mäusen konnte mehr CAP1 in den Homogenaten von Cortex cerebri und Bulbus olfactorius als in den Homogenaten von Thalamus/ Striatum, Hirnstamm und Cerebellum nachgewiesen werden. Für die adulten Tiere wurden Thalamus und Striatum separat und zusätzlich noch das Homogenat der Medulla oblongata analysiert. Für fast alle Gehirnbereiche konnte das gleiche Expressionsniveau für CAP1 gezeigt werden, nur im Thalamus und der Medulla oblongata konnten etwas höhere CAP1 Spiegel nachgewiesen werden. Zusätzlich konnte CAP1 im Bulbus olfactorius, im Cortex cerebri, in der Hippokampusformation, im Striatum, in der Capsula interna und im Cerebellum mit Hilfe indirekter Immunfluoreszenz nachgewiesen werden. In Northernblot Analysen wurde hier eine gleichmäßige Expresison von CAP1 während der Entwicklung von Tag 7-17 gezeigt. Gleichzeitig machten indirekten Immunfluoreszenzstudien an Paraffinschnitten deutlich, daß die CAP1 Expression auf bestimmte Organe beschränkt ist. Die subzelluläre Lokalisation wurde mit indirekter Immunfluoreszenz und mit einem GFP-CAP1 Fusionsprotein an Zellen und zusätzlich durch subzelluläre Fraktionierungen von Zellhomogenaten im Saccharosegradienten untersucht. In Fibroblasten und Keratinozyten kolokalisierte CAP1 mit F-Aktin am Leitsaum. Gleichzeitig war GFP-CAP1 im Wachstumskegel differenzierter Neuroblastomzellen konzentriert. Auch bei Wundheilungsexperimenten, die mit Fibroblasten und Keratinozyten durchgeführt wurden konnte die Lokalisation von CAP1 am Leitsaum der Zellen gezeigt werden. Damit war CAP1 in allen untersuchten Zellen in den Bereichen mit größter Aktindynamik angereichert. In der subzellulären Fraktionierung konnte für CAP1 aber keine Membranassoziation über F-Aktin gezeigt werden. Statt dessen wurde gezeigt, daß CAP1 als Multimer vorliegt.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language in vivo function of CAP1 English
Translated abstract:	Abstract Language The CAP family of proteins belongs to the actin binding proteins and is found in all analysed eukaryotic species. The first member of the family was discovered as a component of the adenylate cyclase in S. cerevisiae. The later CAP homologues were identified in a wide variety of animals, plants and fungi. Mammals express two homologues, CAP1 and CAP2. This work included the construction of a knockout vector for mouse CAP1. In addition, the expression pattern of CAP1 in different organs and the subcellular localization of CAP1 in different cell lines was tested. Genomic ES-cell DNA as a template and the proofreading enzyme PfuTurbo®-DNA-Polymerase were used to amplify the arms of the ko vector by PCR. Together with the neomycin resitance cassette these arms were cloned into a pBS vector. The homologous recombination of the knockout vector with the chromosomal target sequence will result in a frameshift mutation. This will lead to disruption of the function of one CAP1 allele. Putative alternative splice sites could have produced a truncated protein missing the N-terminal domain. After the transfection of the ES-cells with the ko vector, 450 clones were isolated and screened by Southernblot analysis. So far no positive clone was detected. In a Westernblot analyses of homogenized tissues the biggest amounts of CAP1 were detected in thymus, spleen and lung followed by testis, liver and stomach. The lowest expression levels were revealed in heart, skeletal muscle, brain, skin and kidney. The expression of CAP1 was more precisely tested in the brain. In newborn mice the expression level of CAP1 was higher in the cortex and the olfactory bulb than in the homogenates of thalamus/ striatum, brainstem and Cerebellum. In adult mice the thalamus and striatum were tested separately and in addition to the brain areas tested in the newborn mice, Medulla oblongata was tested. For most brain areas a similar expression level of CAP1 was detected. Just in the thalamus and the Medulla oblongata a slightly elevated CAP1 level were observed. In addition to the westernblot analysis, CAP1 could be detected in the olfactory bulb, cortex, hippocampal formation, striatum, Cerebellum and the Capsula interna by indirect immunofluorescence. Northernblot analysis showed an equal expression of CAP1 from embryonic day 7 to day 17. At the same time indirect immunofluorescence studies revealed a restricted expression of CAP1 to several organs. The subcellular localization of CAP1 was examined by indirect immunofluorescence and by expression of GFP-CAP1 fusion protein in cells. Additionally cell homogenates were checked by subcellular fractionation. In fibroblasts and keratinocytes the cytosolic protein CAP1 locallized with F-actin at the leading edges of the cells. In differentiated neuroblastoma cells GFP-CAP1 was concentrated in the growth cone. In wound healing experiments CAP1 is found to be enriched at the leading edge of fibroblasts and keratinocytes too. Taken together CAP1 was enriched in all cases at sites with highest actin dynamics. In the subcellular fractionationing CAP1 couldn´t be shown as associated to the membrane via actin. Instead of this it was shown that CAP1 is forming multimers. English
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Korte, Henning HeKorte@yahoo.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-12474
Date:	2004
Language:	German
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Medicine > Biochemie > Institut I für Biochemie
Subjects:	Life sciences
Date of oral exam:	18 May 2004
Referee:	Name Academic Title Noegel, A. A. Frau Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/1247