Universität zu Köln

Hövel, Klaus (2004). Kristallstruktur und Momentaufnahmen entlang des Reaktionsmechanismus der alpha-L-Arabinofuranosidase. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Die alpha-L-Arabinofuranosidase aus Geobacillus stearothermophilus T-6 (E.C. 3.2.1.55, AbfA) gehört zur Glykosid Hydrolase Familie 51 und hydrolisiert alpha-1,2, alpha-1,3 und alpha-1,5 verknüpfte arabinofuranosidische Seitenketten in Hemicellulosen. Die native AbfA und das Seleno-Methionin Derivat der AbfA wurden in zwei verschiedenen Kristallformen, P21 and R3, kristallisiert. Da keine homologe Struktur einer Glykosidase der Familie 51 bekannt ist, wurde die kristallographische Phaseninformation durch Einsatz der MAD Phasierungstechnik mit Hilfe des Seleno-Methionin Derivats der AbfA gewonnen. Unabhängig davon konnte die Struktur durch den Einsatz eines Platin- und Quecksilberderivats mit Hilfe der MIR Methode gelöst werden. Das Enzym ist als Hexamer organisiert und jedes Monomer besteht aus zwei Domänen: Einer (beta/alpha)8-Domäne und einer 12-strängigen ß-Faltblattdomäne mit jelly roll Topologie. Die katalytische Säure/Base Glu175 und das katalytische Nukleophil Glu294 sind 4.7 Å voneinander entfernt und, wie es für eine Glykosid Hydrolase des Clans GH-A typisch ist, auf den Faltblättern 4 und 7 der (beta/alpha)8-Domäne positioniert. Im Laufe der Arbeit konnten einige hoch aufgelöste Strukturen des Wildtyps und der katalytischen Mutanten im Komplex mit verschiedenen Substraten bestimmt werden (1.2-2.0 Å). Dabei handelt es sich um Michaelis-Menten Komplexe mit natürlichem und synthetischem Substrat und dem kovalenten Zucker-Enzym Reaktionsintermediat. Diese Strukturen repräsentieren zwei stabile Zwischenzustände entlang des Reaktionsmechanismus der AbfA und gestatteten eine eingehende Analyse des Mechanismus'. Basierend auf diesen Strukturen kann die Protonierungs-Trajektorie als anti kategorisiert werden. Der Arabinosezucker ist durch ein komplexes Netzwerk an Wasserstoffbrückenbindungen im aktiven Zentrum der AbfA gebunden. Die zwei katalytischen Glutaminsäuren und die anderen konservierten Residuen im aktiven Zentrum der AbfA tragen durch Ladungsdelokalisierung und spezifische Protein-Substrat Interaktionen zur Stabilisierung des Oxocarbenium-artigen Übergangszustands bei. Während der Hydrolyse findet eine elektrophile Wanderung des anomeren Kohlenstoffatoms um 1.7 Å in Richtung des katalytischen Nukleophils Glu294 statt.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language Crystal structure and snapshots along the reaction pathway of a family 51 arabinofuranosidase. English
Translated abstract:	Abstract Language The alpha-L-Arabinofuranosidase from Geobacillus stearothermophilus T-6 (E.C. 3.2.1.55, AbfA), a family 51 glycosidase, catalyzes the hydrolysis of alpha-1,2, alpha-1,3 and alpha-1,5 L-arabinofuranosidic bonds in arabinose-containing hemicelluloses. Native and Se-Met AbfA were crystallized in two different space groups, P21 and R3. As no homologous structure is known to date for GH-51 enzymes, the phases were obtained using MAD technique with the Se-Met derivative of the enzyme, as well as MIR experiments with mercury and platinum derivatives. The enzyme is a hexamer, and each monomer is organized into two domains: a (beta/alpha)8-barrel and a 12-stranded ß-sandwich with jelly roll topology. The catalytic acid base residue Glu175 and the nucleophile Glu294 are located 4.7 Å apart on ß-strands 4 and 7 of the (beta/alpha)8-domain, as expected from a GH-A clan enzyme. Several high resolution structures of the wild type and mutant enzymes were obtained in complex with different substrates (1.2-2.0 Å). Michaelis complexes with natural and synthetic substrate, and of the covalent arabinofuranosyl-enzyme intermediate represent two stable states in the double dispacement mechanism, and allow thorough examination of the catalytic mechnism. Based on the structures, AbfA utilizes anti-protonation trajectory. The arabinofuranose sugar is tightly bound and distorted by an extensive network of hydrogen bonds. The two catalytic glutamic acids, together with other conserved residues contribute to the stabilization of the oxocarbenium ion-like transition state via charge delocalization and specific protein-substrate interactions. A 1.7 Å electrophilc migration of the anomeric carbon takes place during the hydrolysis as observed for other glycoside hydrolases. English
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Hövel, Klaus apotheke-kesterkamp@t-online.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-12486
Date:	2004
Language:	German
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Chemistry > Institute of Biochemistry
Subjects:	Chemistry and allied sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Arabinofuranosidase , AbfA , Glykosidasen , Familie 51, kovalentes Reaktionsintermediat German arabinofuranosidase , AbfA , family 51 , glycosidase , covalent intermediate English
Date of oral exam:	29 June 2004
Referee:	Name Academic Title Schomburg, Dietmar Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/1248