Universität zu Köln

Neelamegan, Dhamodharan (2004). Characterisation of PhdB, a pleckstrin homology domain containing protein in Dictyostelium discoideum. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Proteins with pleckstrin homology (PH) domains have been shown to be mostly involved in cytoskeletal signalling. We have identified a new protein in Dictyostelium discoideum, whose primary structure analysis reveals the presence of two PH domains along with additional functional domains like CH, RhoGEF and ArfGAP domains. Henceforth the protein is referred to as PhdB (Pleckstrin homology domain containing protein B). Monoclonal and polyclonal antibodies generated against PhdB recognise a 175 kDa protein throughout the developmental differentiation programme of D. discoideum. A GFP fusion protein containing the C-terminal PH domain of PhdB colocalises with F-actin at the pseudopods and is associated with the Triton X-100 insoluble F-actin cytoskeleton. The recombinant C-terminal domain of PhdB also binds to phosphoinositides and actin in vitro. To define the function of the protein we generated null cells lacking the PhdB protein by homologous recombination. The phenotype of the null cells reveals that the protein is necessary for normal cell aggregation during development as PhdB- cells showed a developmental delay and failed to form streams unlike wild type cells during chemotaxis upon a challenge with an external source of cAMP. During further analysis of the developmental defect we observed that the expression of the cell-cell adhesion molecule contact site A (csA) occurred independent of the formation of cell-cell contacts in PhdB- cells. The csA protein is a cAMP induced glycoprotein mediating EDTA-stable contacts. Furthermore, its expresion followed a time course similar to the one observed in wild type and normal levels of csA were reached. However, the presence of the csA did not allow the formation of strong aggregates by PhdB- cells. It therefore appears that the normal expression of csA which we observed during aggregation in PhdB- cells is independent of cell-cell adhesion. Taken together, the abnormal aggregation and the defect in streaming of PhdB- cells indicate that the protein is a component of cell-cell signalling during Dictyostelium aggregation.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language Charakterisierung von PhdB, einem Protein mit Pleckstrin Homologiedomäne in Dictyostelium discoideum German
Translated abstract:	Abstract Language In dieser Arbeit ist ein neues PH-Domänen Protein, PhdB, aus Dictyostelium discoideum charakterisiert worden. PH-Domänen werden häufig in Proteinen gefunden, die an Zytoskelett-assoziierten Signaltransduktionsprozessen beteiligt sind. PhdB ist ein 175 kDa Protein mit zwei PH-Domänen, einer CH-Domäne wie sie in Aktin-bindenden Proteinen vorkommt, einer RhoGEF und einer ArfGAP Domäne. Mono- und polyklonale Antikörper erkennen ein 175 kDa Protein in Westernblots, das während Wachstum und Entwicklung nachweisbar ist. Ein GFP-Fusionsprotein, das die C-terminale PH-Domäne enthält, ist im Aktinkortex der Dictyostelium Zelle lokalisiert, in vitro bindet diese Domäne an Aktin und an Phosphoinositide. Um die Funktion des Proteins zu analysieren, wurden Mutanten geschaffen, in denen das Gen durch homologe Rekombination inaktiviert wurde. Diesen Mutanten fehlt das Protein vollständig. Die Untersuchung der PhdB- Zellen zeigte eine Veränderung in der frühen Entwicklung, in der die Zellen chemotaktisch auf cAMP zuwandern und Zellströme bilden. Während die chemotaktische Reaktion normal war, waren die Zellen nicht in der Lage zu adhärieren und im Zellverbund auf die cAMP-Quelle zuzuwandern. Normalerweise ist dieses Verhalten auf die korrekte Expression von Zell-Zell-Adhäsionsproteinen zurückzuführen. Erstaunlicherweise konnte das csA-Protein, ein wichtiges Zelladhäsionsprotein, in normalen Mengen und mit seinem korrekten zeitlichen Expressionsmuster nachgewiesen werden, ohne dass dadurch die Bildung eines stabilen Zellverbundes stattfand. Zusammenfassend hat die Mutantenanalyse gezeigt, dass PhdB eine Funktion in der frühen Entwicklungsphase von Dictyostelium besitzt und in den geordneten Ablauf der Zelladhäsion involviert ist. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Neelamegan, Dhamodharan ake58@uni-koeln.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-12590
Date:	2004
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Medicine > Biochemie > Institut I für Biochemie
Subjects:	Chemistry and allied sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Pleckstrin , Dictyostelium discoideum , Chemotaxis , Aktin German pleckstrin , Dictyostelium discoideum , chemotaxis , actin English
Date of oral exam:	6 July 2004
Referee:	Name Academic Title Noegel, Angelika A. Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/1259