Centrin - RNAi in Chlamydomonas reinhardtii. A: Analysen der Centrinfunktionen anhand eines centrindefizienten Phänotyps. B: Untersuchungen zur Inaktivierung des Centrin - RNAi - induzierenden Konstruktes in Chlamydomonas

Koblenz, Bettina (2004). Centrin - RNAi in Chlamydomonas reinhardtii. A: Analysen der Centrinfunktionen anhand eines centrindefizienten Phänotyps. B: Untersuchungen zur Inaktivierung des Centrin - RNAi - induzierenden Konstruktes in Chlamydomonas. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

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Abstract

Centrin ist ein ubiquitäres Protein und konnte in den Centrosomen bzw. centrosomverwandten Strukturen vieler eukaryotischer Zellen nachgewiesen werden. Untersuchungen in verschiedenen Organismen sprechen für eine bedeutende Rolle Centrins während der Duplikation und der �de novo�-Bildung von Centriolen bzw. Basalkörpern. In Chlamydomonas reinhardtii ist Centrin darüber hinaus ein Bestandteil fibrillärer Strukturen und ermöglicht somit wahrscheinlich u.a. die Motilität der Zellen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Funktionen Centrins über einen centrindefizienten Phänotyp in der Grünalge Chlamydomonas reinhardtii untersucht. Die Verminderung der Centrinexpression wurde über einen Mechanismus ermöglicht, der den sequenzspezifischen Abbau der Centrin-mRNA einleitete (�RNAi interference�; RNAi). Stämme, die unterschiedliche Mengen an restlichem Centrin exprimierten, ließen Schlüsse über die Empfindlichkeit der unterschiedlichen Centrinfunktionen gegenüber einer sinkenden Proteinkonzentration zu. Die RNAi-Stämme dieser Arbeit bildeten einen Phänotyp aus, der durch eine variable Anzahl an Geißeln bzw. Basalkörpern (BK) und ein Fehlen der centrinhaltigen Strukturen gekennzeichnet war. In stark centrindefizienten RNAi-Stämmen fand eine Verminderung der durchschnittlichen Geißel- bzw. Basalkörperzahl der Zellen statt. Zudem konnten oft unbegeißelte Basalkörper und basalkörperfreie Zellen detektiert werden. Diese Ergebnisse deuten auf Fehler während der Basalkörperreplikation und � reifung hin. Zusätzlich konnten Segregationsdefekte während der Mitose detektiert werden. Eine erhöhte Anzahl an Zellen war mehrkernig und eine verminderte Lebensfähigkeit der Zellen dieser Stämmen konnte nachgewiesen werden. Die unterschiedliche Anzahl bzw. das Fehlen von Basalkörpern störte zudem die Organisation des mikrotubulären Cytoskeletts und der Basalapparat-assoziierten Fasern. In RNAi-Stämmen, die einen hohen restlichen Gehalt an Centrin aufwiesen, waren die Prozesse der Basalkörperreifung und � replikation sowie die Segregation dieser nur geringfügig beeinflusst. Da auch in diesen Stämmen keine centrinhaltigen Fasern mehr ausgebildet wurden, scheinen die Prozesse unabhängig von diesen Fasern abzulaufen. Im Laufe der Zeit konnte eine Inaktivierung des RNAi-induzierenden Kontruktes in allen Stämmen nachgewiesen werden. Stämme, die einen starken centrindefizienten Phänotyp aufwiesen wurden zu einem früheren Zeitpunkt und innerhalb einer kürzeren Zeitspanne inaktiviert als solche, die nur einen milden Effekt ausprägten. Methylierungen der CCGG-Sequenzen in Promotor- bzw. Konstruktbereichen konnten als Ursache zur Stilllegung ausgeschlossen werden. Weitere Untersuchungen, die an diesen inaktiven RNAi-Stämmen durchgeführt wurden, sprechen für einen sequenzspezifischen Mechanismus, der über die Ausbildung von intermediären Zuständen die Inaktivierung des Konstruktes einleitete.

Item Type:

Thesis (PhD thesis)

Translated title:

Title	Language
Centrin - RNAi in Chlamydomonas reinhardtii. A: Analysis of the centrin deficient phenotype B: Studies of the inactivation process of the centrin - RNAi - inducing construct in Chlamydomonas	English

Translated abstract:

Abstract

Language

Centrin, a ubiquitous calcium-binding protein, is a constituent of centrosomes in many eukaryotic cells. In green algae, and other flagellates centrin is also component of fibres associated with the basal apparatus and is predicted to play a role in motility processes. In this work, nuclear transformation with a construct inducing RNAi was used to study the effect of centrin deficiency in Chlamydomonas reinhardtii. Transformants contained different amounts of residual centrin (down to 5% of wildtype) and displayed a variable flagellar number phenotype. Residual centrin was concentrated at the basal bodies (bb) whereas centrin containing fibers were absent or defective. A strong centrin knock-down gave rise to strains with mostly nonflagellated cells and high numbers of cells without bb. These observations indicate a role for centrin during bb replication and maturation. In addition the mitotic segregation of the bb was disturbed in cells displaying a low amount of residual centrin. Additional basal bodies served as extra MTOCs and organized a polycentric microtubular cytoskeleton. In cells without bb the microtubular cytoskeleton was unordered and the organization of the flagella root system was defective. Furthermore, the number of multinucleated cells was increased indicating that aberrant numbers of bb interfered with cytokinesis. The repression of the centrin gene was not stable and all strains lost their mutant phenotype after a period of time. The loss of the mutant phenotype was negatively correlated to the intensity of the effect: strong initial expression resulted in a rapid loss of RNAi effect whereas weaker repression was longer lasting. The inactivation of RNAi was not caused by CCGG methylation of the transgene. Further experiments with the inactive RNAi strains indicate, that the transgene was silenced by a sequence-specific mechanism, which allowed the repression of trancription over an intermediate status.

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