Die WRKY-Transkriptionsfaktorfamilie in Arabidopsis thaliana: Untersuchungen zur Spezifität der Bindung an W-Box-Elemente und weiterführende Analyse von drei ausgewählten Vertretern

Ciolkowski, Ingo (2004). Die WRKY-Transkriptionsfaktorfamilie in Arabidopsis thaliana: Untersuchungen zur Spezifität der Bindung an W-Box-Elemente und weiterführende Analyse von drei ausgewählten Vertretern. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

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Abstract

WRKY-Proteine sind Transkriptionsfaktoren, die charakteristischerweise aus einem Zinkfinger und dem konservierten WRKYGQK-Motiv bestehen. Parallelen zu klassischen Zinkfingern lassen vermuten, dass die Spezifität der DNA-Bindung durch die WRKYGQK-Sequenz vermittelt wird. WRKY-Faktoren binden spezifisch an das W-Box cis-Element, wobei flankierende Basen entscheidend für die Erkennung sind. WRKY-Proteine bilden verschiedene Gruppen mit unterschiedlichen W-Box-Präferenzen. Für WRKY11 und WRKY6 wurde die Bindesequenz als TWGTTGACYWWW bestimmt, deren funktionelle Bedeutung mit dem Motif Mapper Programm bestätigt wurde, da eine Anreicherung in Promotorregionen gegenüber dem Gesamtgenom vorlag. Partikelbeschuss-Experimente mit dem W2-Element, das TTGACC umfasst, als Reporter- und den WRKY-Proteinen 6, 11, 26, 38 und 43 als Effektorkonstrukten zeigten generelle Reportergen-Aktivierung. Mit dem Promotor von SIRK, einem Zielgen von AtWRY6, ergab sich ein differenzierteres Bild. WRKY-Proteine hatten die Fähigkeit, die Expression des Reportergens unterschiedlich gut, sowohl positiv als auch negativ, zu regulieren. Die Regulation durch WRKY-Proteine lief über die Erkennung einzelner W-Boxen oder das Zusammenwirken kombinierter W-Boxen. W-Boxen im Abstand von 0 bis 3 Basen waren in Promotoren deutlich angereichert, genauso wie weitere W-Box-Kombinationen in Abständen, die jeweils einer halben Umdrehung der DNA-Helix oder einem Mehrfachen davon entsprachen. Die Anreicherung impliziert Funktionalität. Drei WRKY-Gene (26, 38 und 43) wurden weitergehend analysiert. Diese WRKY-Proteine zeigten eine konstitutive Lokalisierung im Zellkern. Ein jeweils 2 kb großes Promotor-Fragment wurde zur Analyse des Expressionsmusters eingesetzt. AtWRKY26 zeichnete sich vor allem durch Expression in Trichomen von 3-5 Wochen alten Pflanzen aus. Induzierbar war die Expression durch Kälte, Trockenheit und auch durch Hitze. AtWRKY38 war schwach in Blättern, jedoch stark in Wurzeln von jungen Pflanzen exprimiert und induzierbar durch SA, JA, ACC, flg22 und Verwundung. AtWRKY43 war lediglich in älteren Pflanzen in der Abscissionszone zu detektieren bzw. durch JA zu induzieren. Die Nullmutanten-Analyse von AtWRKY43 lieferte keinen sichtbaren Phänotyp.

Item Type:

Thesis (PhD thesis)

Translated abstract:

Abstract

Language

WRKY transcription factors are zinc finger proteins containing the highly conserved WRKYGQK amino acid strech. Comparison to classical zinc finger proteins suggests, that recognition of the W box cis element is mediated by this sequence. Binding specificity was influenced by bases flanking the W box hexamer. Two different groups of WRKY proteins with distinct binding behaviour have been observed. For WRKY6 and 11 the binding motif TWGTTGACYWWW could be defined. Analysis of the distribution of this consensus sequence within the A. thaliana genome revealed enrichment in promoter regions, suggesting a functional importance of this new motif. Bombardment experiments including WRKY6, 11, 26, 38 and 43 as effector constructs and a reporter construct containing the W2 element 'TTGACC' always led to activation of the reporter gene. Using parts of the SIRK promoter, a target of AtWRKY6, revealed the ability of these WRKY proteins to positively or negatively regulate gene expression. Regulation of gene expression appeared to be mediated by recognition of a certain W box element and/or interaction with combined W-boxes which are 0 to 3 bases apart. These combined W-boxes are enriched in promoter regions and might be functional. This is also true for W boxes with different spacings, which correspond to half-turns of the DNA-helix and suggests formation of multi protein complexes. The WRKY genes 26, 38 and 43 have been analysed in more detail. They encode proteins which are constitutively localized within the nucleus. Expression studies were performed using 2 kb of their respective promoter. AtWRKY26 was expressed in the trichomes of 3-5 week old plants. Expression could be induced by cold, drought and slightly by heat treatments. AtWRKY38 was inducible by SA, JA, ACC, flg22 and wounding, and showed general expression in leaves and strong expression in young roots. The expression AtWRKY43 was hardly detectable, it could be induced in older plants by JA in the flower abscission zone, where it is weakly expressed. Analysis of a knock-out mutant for WRKY43 did not reveal any phenotype.

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