Universität zu Köln

Strelkov, Sergey (2004). Entwicklung und Anwendung einer Methode zur Metabolomanalyse von Corynebacterium glutamicum. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Neben gut etablierten, analytischen Techniken im Proteomics- und Transkriptomicsbereich wird eine ergänzende Metabolomics-Technik für einen kompletten systembiologischen Ansatz benötigt. Heutzutage sind die kompletten Genomsequenzen vieler Organismen vollständig entschlüsselt und frei zugänglich. Doch nur für einen Teil der Gene ist die Funktion bekannt. Bei der Aufklärung von Genfunktionen ist eine analytische Methode nötig, die eine möglichst große Anzahl von Metaboliten erfasst. Hierfür bieten sich massenspektrometrische Techniken wie GC-MS und/oder LC-MS mit ihrer großen Universalität, Selektivität und Einfachheit besonders an. Wegen der großen chemischen Diversität von Metaboliten gegenüber den chemisch relativ homogenen Proteinen oder der mRNA, stellt die Entwicklung einer analytischen Methode zur Metabolomanalyse eine große Herausforderung dar. Der Modellorganismus Corynebacterium glutamicum wird in der Industrie für die Produktion von L-Glutamat und L-Lysin benutzt. Es besteht ein großes Interesse an der Optimierung von Produktionsstämmen, aber das Wissen über die metabolische Organisation in der Zelle ist limitiert. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine GC-MS basierende Methode zur Metabolomanalyse entwickelt und etabliert. Die aufgenommenen GC-MS-Chromatogramme enthalten die Information von ca. 1000 detektierten Komponenten. Davon lassen sich 300 Metabolite quantitativ, reproduzierbar messen, das entspricht ca. 50% der erwarteten Metabolite. Von diesen wurden im Rahmen dieser Arbeit 121 (88 in der polaren Phase, 33 in der lipophilen Phase) identifiziert. Durch eine Methodenoptimierung war es möglich, eine Präzision innerhalb von 6% mittlerer Standardabweichung bei der Messung allein und 15% bei Extraktion und Probennahme zusammen zu erreichen. Die Anwendung dieser Methode für die funktionelle Genomanalyse wurde am Beispiel von Deletionsmutanten des Trehalose-Stoffwechselweges durchgeführt. Entsprechend den Erwartungen ließ sich nach der Deletion der Trehalose-6-phosphat- phosphatase (kodiert durch OtsB) eine ca. 100-fache Akkumulation des entsprechenden Substrates Trehalose-6-phosphat messen. Umgekehrt führte eine Deletion des Gens OtsA (kodiert für Trehalose-6-phosphatsynthase) zu einer Abnahme Trehalose-6-phosphat. Zur Evaluierung der Methodenempfindlichkeit wurden Wachstumsbedingungen (Temperatur und Kohlenstoffquelle) variiert. Es wurden dabei multiple Änderungen beobachtet, die den experimentellen Fehler überstiegen. Damit die hier entwickelte Methode als Datengrundlage für eine computergestützte Modellierung metabolischer Netzwerke eingesetzt werden kann, ist eine Kenntnis über die tatsächlichen intrazellulären Metabolitkonzentrationen notwendig. Daher wurden für 71 der identifizierten Metabolite Kalibrationskurven aufgenommen, um den jeweiligen linearen Massenbereich zu charakterisieren und Responsefaktoren zu ermitteln. Als ergänzende Technik zur Analyse von hochmolekularen nicht flüchtigen GC-MS Verbindungen wurde mit der Etablierung eines HPLC-HILIC-ESI-MS Ansatzes begonnen.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language Development and application of a method for the metabolomic analysis of Corynebacterium glutamicum English
Translated abstract:	Abstract Language For complete systems biology approach a metabolomic analysis technique should be developed to complement already well established proteomic and transcriptomic analytical techniques. To date the complete genome sequences are freely available for a variety of organisms. However only a part of genes are functionally classified. For the elucidation of gene function an analytical method for simultaneous analysis of maximally possible number of metabolites must be developed. Mass spectrometry based techniques such as GC-MS and LC-MS are very suitable for this task, due to their universality, selectivity and simplicity. Because of wide chemical diversity of metabolites comparative to relatively homogenous proteins and mRNA the development of metabolic analysis method is more difficult. The model organism Corynebacterium glutamicum is used for the industrial production of L-glutamate and L-lysine. A lot of attention is paid on the optimization of production strains, but the knowledge about metabolic organization in the cell is limited. In this work, a GC-MS based method for metabolomic analysis was developed and established. The GC-MS chromatograms contain the information about ca. 1000 detected components. Approximately 300 metabolites can be quantitatively reproducible analyzed and represent ca. 50% of all expected metabolites. From these 121(88 in the polar phase, 33 in the lipophilic phase) were identified. After a method optimization it was possible to achieve a precision within 6% of average standard deviation on the stage of only GC-MS measurement and 15% together with sampling and extraction. The application of the method for the functional genomics approach was demonstrated on the example of trehalose pathway knock out mutants. According to the expectations after the knock out of the trehalose-6-phosphatephosphatase (coded by OtsB) the 100 times accumulation of the corresponding substrate trehalose-6-phosphate was observed. On the other side the knock out of the gene OtsA (codes for trehalose-6-phosphatsynthase) caused the decrease in the concentration of trehalose-6-phosphate. For the evaluation of the sensitivity of the method the growth conditions (temperature and carbon source) were varied. A multiple changes were observed, which were larger as experimental error. To apply the developed method as a data source for a computer modeling of metabolic pathways, information about real intracellular metabolite concentrations is required. Calibration curves were constructed for 71 of identified metabolites. The linear working area was characterized and response factors were found out. For the analysis of high molecular nonvolatile in GC-MS compounds it was started with the development of HPLC-HILIC-ESI-MS approach. English
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Strelkov, Sergey Sergey.Strelkov@uni-koeln.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-12684
Date:	2004
Language:	German
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Chemistry > Institute of Biochemistry
Subjects:	Chemistry and allied sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Metabolom , Metabolit , GC-MS , Massenspektrometrie , Corynebacterium German Metabolic , Metabolomic analysis , GC-MS , Metabolite , Corynebacterium English
Date of oral exam:	11 July 2004
Referee:	Name Academic Title Schomburg, Dietmar Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/1268