Universität zu Köln

Marko, Marija (2004). The role of Dictyostelium discoideum annexin C1 in cellular responses. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Annexins are big family of proteins which are binding to phosphplipids in a Ca2+-dependent manner. A lot is known about their distribution in the cells and tissues, their involvement in endocytosis and exocytosis, vesicular trafficking and rearrangement of the cytoskeleton. For several annexins mouse knock out models are established. However, loss of one particular annexin had relatively mild effects suggesting compensation of the lost annexin function by other annexins. This study focused on Dictyostelium discoideum annexin C1, its dynamic behavior and possible interactions with other proteins. GFP-tagged full length annexin, a mutated form of annexin and the annexin core domain were used to study involvement of annexin in cellular processes in vivo and in vitro, with emphasis on processes like pinocytosis, phagocytosis, osmoregulation and development. Dictyostelium annexin C1 localizes in the cell cytosol and nucleus and on the plasma membrane. In the cytosol annexin is associated with internal membranes. Fractionation of membranes on discontinuous sucrose gradient showed that annexin C1 was present on plasma membrane, endosomal and lysosomal membranes, as well as in Golgi membranes and in a lesser amounts in ER fraction. In addition, co-immunostaining with several protein markers revealed annexin C1 in association with endosomes and contractile vacuoles. Although its localization on contractile vacuoles suggested a role in osmoregulation, mutant lacking annexin (SYN¯) behaved similar to wild type cells (AX2) under osmotic stress conditions. Despite the presence of annexin C1 on pinosomes and phagosomes the SYN¯ mutant was not impaired in endocytosis and exocytosis when compared with AX2 and showed an increased rate of phagocytosis. In accordance with this is the decreased rate of phagocytosis observed with cells overexpressing annexin. Furthermore we observed in vivo translocation of annexin from the cytosol to the plasma membrane upon a decrease in cytosolic pH. This finding showed that the protein could bind to phospholipids in the absence of Ca2+ and was in accordance with previously published in vitro data for annexin A5 and B12. We also found that annexin C1 associated with Triton X-100 insoluble pellet only in the presence of Ca2+. A mutation in one Ca2+-binding site in the third annexin repeat affected this behavior. Considering proposed high affinity for Ca2+ of this particular Ca2+-binding site and the previously described cooperation in binding of Ca2+ we speculate that his particular substitution of aspartic acid residue at the position 293 with alanine reduced protein affinity for binding of Ca2+ and eventually affected binding of Ca2+ to other Ca2+-binding sites.Gel filtration and immunoprecipitation experiments revealed the presence of annexin C1 monomers in the cytoplasm and interactions with two small Ca2+-binding proteins, CBP2 and DdPEF-2. Furthermore, we found annexin to be phosphorylated but the physiological role of phosphorylation is needed to be further studied in detail. Taken together, annexin C1 is not crucial for the survival of Dictyostelium. In annexin minus mutant SYN¯ however development was noticeably affected and was retarded by more than four hours and not all multicellular structures finally developed into fruiting bodies consisting of spore and stalk cells. Although all fusion proteins showed same localization in slugs, stalks and spore cells, impairment in development of SYN¯ cells could only be rescued by the full length protein pointing out the crucial importance of annexin function for development.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language Die Rolle von Dictyostelium discoideum Annexin C1 in zellulären Antworten German
Translated abstract:	Abstract Language Annexine sind eine große Familie von Proteinen, die Phospholipide in Abhängigkeit von Kalziumionen binden. Viele Daten existieren über die Verteilung der Annexine in Zellen und Geweben und über deren Beteiligung an Exo- und Endozytose, Vesikeltransport und der Dynamik des Zytoskeletts. Verschiedene Annexin-Gene wurden in der Maus inaktiviert. Die relativ milden Phänotypen der einzelnen �Knock-Outs� suggerieren jedoch Kompensationseffekte (eine zum Teil redundante Funktion) durch vorhandene andere Annexine. Der Fokus der vorliegenden Arbeit lag auf dem dynamischen Verhalten und den Protein-Protein- Interaktionen von Annexin C1 aus Dictyostelium discoideum. Annexin, eine mutierte Form von Annexin und die Annexin �core-domain�, wurden als GFP-Fusionsprotein zur Untersuchung der Rolle von Annexin bei zellulären Prozessen in vivo und in vitro verwendet. Das Augenmerk wurde hierbei auf die Pinozytose, Phagozytose, Osmoregulation und Entwicklung gelegt. Dictyostelium Annexin C1 wurde im Zytosol, im Kern und an der Plasmamembran gefunden. Im Zytosol wurde Annexin in Assoziation mit internen Membranen gefunden. Zellfraktionierungsexperimente mittels Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation zeigten, dass Annexin C1 sowohl in der Plasmamembranfraktion als auch in endosomalen, lysosomalen und Golgi-Fraktionen vorhanden war. In geringeren Mengen wurde es in der ER-Fraktion gefunden. Immunmarkierungen gegen verschiedene bekannte Proteine zeigten in der Fluoreszensmikrosskopie, dass Annexin C1 in Assoziation mit Endosomen und der kontraktilen Vakuole vorliegt. Die Annexin C1-Lokalisierung an internen Membranen und die beobachtete Dynamik in der Lokalisierung in Antwort auf Veränderungen könnte eine Beeinträchtigung einer Vielzahl von membranassoziierten Prozessen nahelegen. Eine detaillierte Untersuchung der Osmoregulation, der Pinozytose und Phagozytose hat dies jedoch nicht gezeigt. Es wurde sogar eine verbesserte Phagozytoserate in SYN¯ Zellen beobachtet. Dies lässt zumindest den Schluss zu, dass Annexin C1 eine Bedeutung für den Membranfluss besitzt. Annexin C1 ist nicht essentiell zum Überleben von Dictyostelium. In einer Annexin defizienten Mutante SYN¯ war jedoch der Entwicklungszyklus beeinflusst. Der Entwicklungszyklus war um mehr als vier Stunden verzögert. Obwohl alle verwendeten Fusionsproteine eine identische Lokalisation in �slugs�, Stiel- und Sporenzellen aufwiesen, konnte ausschließlich das Vollängenfusionsprotein den Phänotyp der Mutanten aufheben. Dieser Befund weist auf die Bedeutung von Annexin für die Multizellularität hin. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Marko, Marija marija_marko@hotmail.com UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-12818
Date:	2004
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Medicine > Biochemie > Institut I für Biochemie
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Annexin, Dictyostelium discoideum,endocytosis English
Date of oral exam:	12 February 2004
Referee:	Name Academic Title Noegel, Angelika Prof.Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/1281