Universität zu Köln

Vieira Breitwieser, Otilia (2004). Leguminous Lectins Bind Non-specifically to DNA. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

The interaction between leguminous lectins and DNA was investigated by using the 4.731 bp plasmid pEGFP-C1, which carried the gene of the green fluorescent protein. Supercoiled or nicked circular DNA molecules as well as subfragments of the whole plasmid were used as binding partners. In the binding assay, the lectin was incubated with DNA, and the formation of the lectin-DNA-complex was analyzed by electrophoresis in agarose gels. A concentration-dependent electrophoretic mobility shift of the DNA was observed with the lectins ConA, ConBn, ConBr, ConM, ConG, Dviol, Dvirg, LcA and PHA-E. No DNA binding activity could be detected for SBA, PHA-L, PNA and VVLB4 lectins. The binding of ConA to DNA was not sequence-specific since DNA of different sources and sizes bound this lectin. The kinetics of ConA-DNA-binding indicated that the complexes were formed very fast, probably in a matter of seconds. The size of the ConA-DNA-complexes was proportional to the ConA-concentration, but a saturation point of maximal binding could not be estimated. Upon protease digestion of the lectin in the DNA-lectin complex, the bulk of the DNA could be recovered intact. The interaction ConA-DNA was investigated under different pH and ionic conditions. A direct correlation between pH and complex formation was observed. Moderate ionic strength inhibited ConA-DNA complex formation, and an already formed complex was disrupted by the subsequent adjustment to high ionic concentrations. A pre-incubation of ConA with metal ions Ca2+, Mn2+ or Mg2+ reduced dramatically the formation of ConA-DNA-complexes. EDTA influenced the formation of the complex with DNA and, for a range of concentrations, complex formation was enhanced. The pre-incubation of ConA with 2-D-deoxyribose, the sugar component of the DNA, had no effect on the extent of complex formation. ATP strongly inhibited complex formation, but was not able to disrupt preformed complexes. A previous exposition of ConA to a-methyl-D-glucopyranoside and/or to a-methyl-D-mannopyranoside reduced complex formation, while galactose did not. ConA-DNA-complex formation in the presence of anti-ConA-antibodies altered the electrophoretic migration of the complexes. ConA-DNA complexes were able to bind to a Sephadex column and could be eluted with glucose and/or mannose solutions. ConA submitted to dialysis against EDTA-containing buffers was able to bind to DNA but the formed complexes were not able to bind to the Sephadex column. The hemagglutination titer obtained after ConA-DNA-complex formation was reduced in comparison to the titer obtained by ConA alone. Upon ConA-DNA complex formation, DNA-bound ConA (peakI) could be separated from free-ConA (peak II) by gel filtration on a BioGel agarose column. Whereas the DNA-bound ConA did not agglutinate erythrocytes, free-ConA conserved its ability to cause hemagglutination. CD-spectrum analyses of BioGel-purified ConA-DNA-complexes confirmed the presence and the relative abundance of DNA and ConA in the complex. Preliminary experiments to target ConA-DNA-complexes to mammalian cells in culture indicated successful transfer and expression of the pEGFP-C1 reporter plasmid in a limited number of cells. The biological importance and possible applications of lectin-DNA-complexes was discussed.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Die Interaktion zwischen Leguminosae Lektinen und DNA wurde mit dem 4.731 Basenpaar langen pEGFP-C1 Plasmid, welche das Gen für das grün fluoreszierende Protein kodiert, untersucht. Supercoiled oder genickte zirkuläre DNA Moleküle, sowie Fragmente des gesamten Plasmids wurden als Bindungspartnern verwendet. Während der Bindungsreaktion wurden die Lektine mit der DNA inkubiert und die entstandenen Lektin-DNA-Komplexe wurden durch Agarose Gel Elektrophorese analysiert. Eine konzentrationsabhängige elektrophoretische Retardierung der DNA wurde bei den Lektinen ConA, ConBn, ConBr, ConM, ConG, Dviol, Dvirg, LcA und PHA-E beobachtet. Es konnte keine DNA bindende Aktivität bei den Lektinen SBA, PHA-L, PNA und VVLB4 beobachtet werden. Die Bindung von ConA an DNA war nicht sequenzspezifisch, weil DNA unterschiedlicher Länge und Herkunft von diesem Lektin gebunden werden konnte. Die Kinetik der ConA-DNA Bindungsreaktion weist darauf hin, dass die Reaktion sehr schnell erfolgte, möglicherweise innerhalb von Sekunden. Die Grösse der ConA-DNA-Komplexen war proportional zu der Konzentration von ConA, aber eine Sättigungskonzentration der maximalen Bindung konnte nicht ermittelt werden. Die DNA konnte durch proteolytischen Behandlung aus den ConA-DNA-Komplexe in intakter Form isoliert werden. Die Interaktion ConA-DNA wurde unter unterschiedlichen pH Werten und ionischen Bedingungen untersucht. Eine direkte Korrelation zwischen pH-Werten und Komplexbildung konnte beobachtet werden. ConA-DNA-Komplex Bildung wurde durch milde ionische Konzentrationen inhibiert, und gebildete Komplexe konnten durch eine Erhöhung der Ionenkonzentration zerstört werden. Eine vorherige Inkubation von ConA mit den Metallionen Ca2+, Mn2+ oder Mg2+ führte zu einer Verringerung der ConA-DNA-Komplexbildung. EDTA hat die Bildung von ConA-DNA-Komplexen beeinflusst und für eine Reihe von EDTA-Konzentrationen war die Komplexbildung sogar verstärkt. Eine Vorinkubierung von ConA mit 2-D-Deoxyribose, die Zuckerkomponente der DNA, hatte keinen Einfluss auf die Komplexbildung. ATP hat die Bildung von ConA-DNA-Komplexen stark inhibiert, aber bereits gebildete Komplexe konnte nicht durch Zugabe von ATP zerstört werden. Eine vorherige Inkubierung von ConA mit a-methyl-D-Glucopyranosiden oder a-methyl-D-Mannopyranosiden hat die Komplexbildung stark reduziert, Galaktose jedoch nicht. ConA-DNA-Komplexbildung in Anwesenheit von Anti-ConA-Antikörper führte zu eine Veränderung der elektrophoretischen Mobilität des Komplexes. ConA-DNA-Komplexe waren in der Lage an eine Sephadexsäule zu binden und wurden durch Zugabe von Glucose oder Mannose Lösungen eluiert. ConA-Moleküle, die gegen eine EDTA-haltige Pufferlösung dialysiert wurden, konnte an DNA binden, aber die entstandene Komplexe konnten nicht an die Sephadexsäule binden. Der Hemagglutinationstiter nach ConA-DNA-Komplexbildung war im Vergleich zu dem durch ConA alleine verursacht Titer reduziert. Eine Trennung von DNA-gebundenem ConA (Peak I) und freiem ConA (Peak II) konnte durch Chromatographie in BioGel Agarose Säule erreicht werden. Während das freie ConA Erythrocyten agglutinieren konnte, konnte das DNA-gebundene ConA keine Agglutination verursachen. CD-Spektrum Analyse von BioGel gereinigten ConA-DNA-Komplexen bestätigten die Anwesenheit und die relative Mengen von DNA und ConA in den Komplexen. Anfängliche Experimente zur Übertragung der ConA-DNA-Komplexe in kultivierte Säugerzellen haben gezeigt, dass das pEGFP-C1 Reporterplasmid in eine begrenzten Anzahl von Zellen erfolgreich aufgenommen und exprimiert wurde. Die biologische Relevanz und die mögliche Anwendungen von Lektin-DNA-Komplexen wurden diskutiert. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Vieira Breitwieser, Otilia otiliav@web.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-12865
Date:	2004
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Biology > Institute for Genetics
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Lektine , DNA , Interaktion , Protein , Komplex German lectin , DNA , interaction , protein , complex English
Date of oral exam:	1 February 2004
Referee:	Name Academic Title Doerfler, Walter Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/1286