Universität zu Köln

Pennartz, Sandra (2004). Gene expression analysis of neuronal precursors from adult mouse brain and differential screen for neural stem cell markers. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

In the adult mouse brain, neuronal precursor cells continuously emanate from neural stem cells (NSC) in the subventricular zone (SVZ) and migrate into the olfactory bulb (OB) where they differentiate to serve as replenishment for GABAergic interneurons. During the migration process, PSA-NCAM (Polysialic acid-Neural cell adhesion molecule) specifically marks the neuronal precursors (PSA+ cells). This phenomenon was exploited in the framework of this doctoral thesis to isolate a homogeneous cell population of neuronal precursor cells using Fluorescence-activated cell sorting. Here, the first comprehensive picture of the gene expression in PSA+ precursors was generated using Serial Analysis of Gene Expression (SAGE). Comparison of SAGE data for PSA+ cells and for adult total brain (ATB) led to the identification of precursor-enriched genes. For selected genes, the results were validated using cDNA microarrays and quantitative real-time PCR, and the expression was analyzed at the cellular level in mouse brain using in situ hybridizations. Genes previously described in this context like the proliferation inhibitor CD24, the sialyltransferase STX and the Reelin receptor ApoER2 confirmed the identity of the precursor cells and the accuracy of the SAGE. Individual characterized genes that were so far unknown in the PSA+ cell population were identified as well as functional groups of genes by means of cluster analysis of SAGE data. The presence of transcription factors of the Sox and Dlx families, Pax6 and Meis2 indicated that secondary neurogenesis might be largely controlled by the same factors that are active during development. Clusters for apoptosis and proliferation are both upregulated. The high expression of chemotactic factors in the neuronal precursors suggests that they might be involved in neuronal cell migration. In addition, novel genes like RIKEN 3110003A17 were observed. First functional data based on the SAGE are being generated in the framework of our collaboration with the Developmental Biology Institute of Marseille. Given that a lack of markers for NSC considerably impedes progress in NSC biology, the second part of this work aimed at identifying potential NSC markers by comparing SAGE data for embryonic stem (ES) cells, PSA+ cells and ATB. The selection strategy was based on two assumptions. First, in a hierarchical order of developmental potential, ES cells are positioned above NSC, which are above restricted precursors that in turn are above adult neurons and glia. Second, the genetic programs of ES cells and NSC overlap. Thus, genes that are highly expressed in ES cells and downregulated or absent in PSA+ neuronal precursors and ATB should in part also be expressed by the few stem cells in the adult brain. Eight candidates coding for cell surface proteins were identified from the resulting list of candidates and were investigated. Due to a public database mistake in situ hybridizations were performed for the glutamate transporter GLT1 and demonstrated expression in embryoid bodies, neurospheres and, strikingly, in the SVZ, the neurogenic area of the mouse forebrain. Taken together, this doctoral thesis generated the first gene expression profile for PSA+ neuronal precursors, which -together with the SAGE library for Bruce-4 ES cells- will serve as a starting basis for future functional analysis.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language Genexpressionsanalyse neuronaler Vorläuferzellen aus adultem Maushirn und differentielle Suche nach neuralen Stammzellmarkern German
Translated abstract:	Abstract Language Im adulten Maushirn gehen in der subventrikulären Zone (SVZ) fortwährend neuronale Vorläuferzellen aus neuralen Stammzellen (NSZ) hervor und migrieren in den Bulbus olfactorius (OB), wo sie in GABAerge Interneuronen differenzieren. PSA-NCAM (Polysialic acid-Neural cell adhesion molecule) wird während des Migrationsprozesses spezifisch von den unreifen neuronalen Zellen (PSA+ Zellen) exprimiert. Diese Tatsache wurde im Rahmen dieser Doktorarbeit genutzt, um eine homogene Population von neuronalen Vorläuferzellen per FACS (Fluorescence-activated cell sorting) zu isolieren. Die Genexpression der PSA+ Zellen wurde umfassend mit Hilfe der Seriellen Analyse der Genexpression (SAGE) untersucht. Der Vergleich der SAGE-Daten von PSA+ Zellen und adultem Gesamthirn (ATB) führte zur Identifizierung von Genen, die in den Vorläuferzellen überexprimiert sind. Für ausgewählte Gene wurden die SAGE-Ergebnisse mittels cDNA Microarray und quantitativer Real-time PCR validiert und die zelluläre Expression im Maushirn mit Hilfe von in situ Hybridisierungen analysiert. Zuvor in diesem Zusammenhang beschriebene Gene wie der Proliferationsinhibitor CD24, die Sialyltransferase STX und der Reelin-Rezeptor ApoER2 bestätigten die Identität der Vorläuferzellen und die Präzision der SAGE. Einzelne bereits charakterisierte, aber in der PSA+ Zellpopulation noch unbekannte Gene wurden identifiziert ebenso wie die konzertierte Expression funktioneller Gengruppen. Das Vorkommen von Transkriptionsfaktoren der Sox- und Dlx- Familie, Pax6 und Meis2 weist daraufhin, dass die sekundäre Neurogenese weitgehend von den gleichen Faktoren kontrolliert wird wie die primäre in der Embryogenese. Gene für Apoptose und Proliferation werden beide stark exprimiert. Die auffallend hohe Expression chemotaktischer Faktoren legt nahe, dass diese bei der neuronalen Migration eine Rolle spielen könnten. Außerdem wurden gänzlich uncharakterisierte Gene wie zum Beispiel RIKEN 3110003A17 beobachtet. Im Rahmen unserer Kollaboration mit dem Developmental Biology Institute of Marseille entstehen erste auf der SAGE basierende funktionelle Daten. Das Defizit an Markergenen für NSZ beeinträchtigt den Fortschritt in der Stammzell-forschung. Daher war ein weiteres Ziel dieser Arbeit, potentielle NSZ-Marker durch den Vergleich von SAGE-Daten für emybronale Stammzellen (ES-Zellen), PSA+ Zellen und ATB zu identifizieren. Hierzu wurde eine SAGE-Datenbank für Bruce-4 ES-Zellen erstellt. Die verwendete Selektionsstrategie basierte auf zwei Annahmen: Erstens, das Entwicklungs-potential nimmt von ES-Zellen über NSZ, über neuronale Vorläuferzellen bis hin zu adulten Neuronen und Glia ab. Zweitens, die genetischen Programme von ES-Zellen und NSZ überlappen. Unter diesen Voraussetzungen sollten einige der Gene, die in ES-Zellen stark exprimiert werden, aber nur schwach oder gar nicht in PSA+ Vorläuferzellen und ATB, in den wenigen NSZ im Gehirn aktiv sein. Acht Gene, die für Zelloberflächenproteine kodieren, wurden von der resultierenden Kandidatenliste ausgewählt und untersucht: Aufgrund eines fehlerhaften Eintrags in einer öffentlichen Datenbank wurde die Expression für den Glutamattransporter GLT1 mit Hilfe von in situ Hybridisierungen untersucht und in Embryoid bodies, in Neurospheres und bemerkenswerterweise in der SVZ, der neurogenen Zone im adulten Gehirn, nachgewiesen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde das erste Genexpressionsprofil PSA+ neuronaler Vorläuferzellen erstellt, welches gemeinsam mit den SAGE-Daten der Bruce-4 ES-Zellen eine Ausgangsbasis für zukünftige funktionelle Analysen darstellt. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Pennartz, Sandra sandrap@miltenyibiotec.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-13202
Date:	2004
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Biology > Institute for Genetics
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language PSA-NCAM, Neuonale Vorläuferzellen, SAGE, Embryonale Stammzellen, Neuale Stammzellen German PSA-NCAM, neuronal precursors, SAGE, ES cells, Neural stem cels English
Date of oral exam:	2 November 2004
Referee:	Name Academic Title Korsching, Sigrun Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/1320