Macroarray analysis of gene transcription during sucrose accumulation in sugar beet (Beta vulgaris L.) root: identification of developmental and metabolism related candidate genes

Bellin, Diana (2003). Macroarray analysis of gene transcription during sucrose accumulation in sugar beet (Beta vulgaris L.) root: identification of developmental and metabolism related candidate genes. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

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Abstract

The presented work integrates molecular data on gene expression with anatomical and biochemical data to analyze the development and the sucrose accumulation process in sugar beet (Beta vulgaris L.) roots. Sugar beet is a biennial Chenopodiacean plant, and it is the major crop for sucrose production in temperate regions. A special root morphology and physiology allow the accumulation of sucrose up to 20% of the fresh weight of the mature root. Approaches to study this storage process at the molecular level have so far been limited to known genes involved in pathways related to sugar metabolism which were mapped and tested for their association with QTLs for sugar yield and quality (Schneider et al., 1999, 2002). In the study presented here, transcription levels in sugar beet roots were analyzed to select candidate genes for the sucrose accumulation process. For this purpose macroarrays were generated from two cDNA collections. The first experiment was performed with 3840 redundant sugar beet cDNAs. A procedure for the analysis including control steps was developed. The performance of the macroarrays was evaluated and compared to commercially produced nylon filters. Both systems could detect transcripts present in as little as 10 copies per cell in agreement with reports by Desprez et al. (1998). Their capacity to analyse transcripts of low abundance was demonstrated in a case study using resistance gene analogues (RGAs). Within an interval of two-fold variation in signal intensities, reproducibility between spots on the same filter was determined to be 98.9%, between spots on different filters 89.8%, and reproducibility after hybridization with two probes synthesized from the same poly(A)+RNA sample was 97.6%. Hybridizations with probes synthesized from different field grown samples of the same organ showed reproducibility for 69.7% of the spots on average. Some precautions were introduced to reduce the sampling effects caused by the variability of environmental conditions. Expression profiles from roots, leaves and inflorescences were generated for 2048 unique cDNAs of the first cDNA clone set. Expression values for each organ were determined by stringent statistical analysis based on eight replica for each clone. Differential expression among the three organs was shown for 917 unique cDNAs, and for 76 unique cDNAs, the amount of detected transcript in roots was at least twice as high as in other organs. For 40 of them a map position was identified and linkage to QTLs is discussed. Additionally, possible functions of preferentially root-expressed candidate genes in taproot morphology and physiology are proposed. As a technical validation, macroarray expression data were confirmed by Northern blot analysis and quantitative RT-PCR experiments. The second set of macroarray experiments was performed with 11520 unique cDNA clones to identify candidate genes in sugar beet roots related to sucrose accumulation or development. For this purpose, a time-course experiment was repeated in two different years. Plants were characterized morphologically and metabolically with respect to their sucrose content during the development. Among the genes differentially expressed in the development, 599 clones with highest expression in the early stages of the first vegetation period were identified in both years. For additional 175 clones, a reproducible preferential expression in the last stages of the development was demonstrated. These candidate genes were classified with respect to their function, and their putative role during development and sucrose accumulation is discussed. Additionally, strategies to focus on the validation of candidates related to sucrose accumulation are discussed. In conclusion, the macroarray technology as established here, together with the selection and characterization of appropriate physiological samples, proved to be a valuable tool to identify new candidate genes related to development and to the sucrose accumulation in the sugar beet root. This is of special importance to sugar beet research because the considered processes cannot be analyzed in model systems without a root storage organ for sucrose.

Item Type:

Thesis (PhD thesis)

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Abstract

Language

In der vorgelegten Arbeit werden molekulare Daten zur Genexpression mit anatomischen und biochemischen Daten integriert, um die Entwicklung und den Prozeß der Saccharoseakkumulation in der Wurzel der Zuckerrübe (Beta vulgaris L.) zu analysieren. Die Zuckerrübe ist eine zweijährige Pflanze, die zur Familie der Chenopodiaceen gehört. Sie ist eine wichtige Nutzpflanze zur Produktion von Saccharose in der gemäßigten Klimazone. Ihre spezielle Wurzelmorphologie und ?physiologie erlauben die Akkumulation von bis zu 20% Saccharose bezogen auf das Frischgewicht der reifen Wurzel. Ansätze, diesen Einlagerungsprozeß auf molekularer Ebene zu analysieren, waren bis jetzt auf bekannte Gene des Zuckerstoffwechsels beschränkt. Solche Gene wurden bereits genetisch kartiert und auf Assoziation mit QTLs für Zuckergehalt und ?qualität hin überprüft (Schneider et al., 1999, 2002). In der hier vorgelegten Arbeit wurden Transkriptionsprofile in den Wurzeln der Zuckerrüben untersucht, um Kandidatengene für die Saccharoseakkumulation auszuwählen. Zu diesem Zweck wurden Makroarrays von zwei cDNA Kollektionen hergestellt. Das erste Experiment wurde mit 3840 redundanten Zuckerrüben cDNAs durchgeführt. Ein Protokoll für die Analyse einschließlich relevanter Kontrollen wurde erstellt. Die Qualität der Makroarrays wurde evaluiert und mit kommerziell produzierten Nylonfiltern verglichen. In beiden Systemen konnten Transkripte, die nur in 10 Kopien pro Zelle vorkamen, nachgewiesen werden. Dieses Ergebnis stimmt mit veröffentlichten Resultaten von Desprez et al. (1998) überein. Die Sensitivität bei der Analyse schwach exprimierter Transkripte wurde für Resistenzgenanaloga (RGAs) erfolgreich getestet. Innerhalb eines Intervalls von einer Abweichung der Signalintensitäten um den Faktor zwei betrug die Reproduzierbarkeit zwischen Signalen desselben Filters 98.9%, die Reproduzierbarkeit von Signalen verschiedener Filter 89.8%, und die Reproduzierbarkeit von Signalen nach der Hybridisierung mit zwei Proben, die von derselben poly(A)+RNA synthetisiert wurden, lag bei 97.6%. Hybridisierungen, die mit Proben von verschiedenen im Feld angezogenen Pflanzen durchgeführt wurden, zeigten eine Reproduzierbarkeit von 69.7% im Durchschnitt. Es wurden Parameter eingeführt, um Effekte, die durch Umweltvariabilität hervorgerufen werden, zu reduzieren. Für 2048 nicht-redundante cDNA Klone des ersten cDNA Klonsets wurden Expressionsprofile von Wurzeln, Blättern und Infloreszenzen generiert. Expressionsdaten für jedes Organ wurden einer stringenten statistischen Analyse unterworfen, die auf acht Wiederholungen für jeden Klon basiert. Für 917 nicht-redundante cDNAs wurde differentielle Expression zwischen den drei Organen nachgewiesen. Davon zeigten 76 cDNAs eine wenigstens zweifach erhöhte Expressionsstärke in Wurzeln im Vergleich zu den anderen Organen. Für 40 dieser cDNAs wurde der korrespondierende Genort kartiert, und die Korrelation mit QTL Positionen wird diskutiert. Zusätzlich werden mögliche Funktionen für die präferentiell in der Wurzel exprimierten Transkripte vorgeschlagen. Zur technischen Überprüfung wurden die Makroarray Daten einiger Klone durch Northern Analyse und quantitative RT-PCR bestätigt. Die zweite Serie von Makroarrayexperimenten wurde mit 11520 nicht-redundanten cDNA Klonen durchgeführt, um Kandidatengene, die bei der Akkumulation der Saccharose und der Rübenentwicklung eine Rolle spielen, zu identifizieren. Zu diesem Zweck wurde eine Kinetik zur Rübenentwicklung in zwei verschiedenen Jahren wiederholt. Die Pflanzen wurden morphologisch und in Bezug auf ihren Saccharosegehalt hin während der Entwicklung untersucht. Unter den differentiell exprimierten cDNAs waren 599, die die höchste Expression in den frühen Stadien der ersten Vegetationsperiode in beiden Jahren zeigten. Für weitere 175 Klone wurde eine reproduzierbare präferentielle Expression im Reifestadium gefunden. Die entsprechenden Kandidategene wurden im Hinblick auf ihre Funktion klassifiziert, und ihre mögliche Rolle während der Entwicklung und der Saccharoseakkumulation wird diskutiert. Zusätzlich werden Strategien zur Validierung von Kandidatengenen vorgestellt. Zusammenfassend läßt sich sagen, daß die hier etablierte Makroarraytechnologie zusammen mit der Auswahl und Charakterisierung von physiologisch relevanten Proben ein wertvolles System sind, um neue Kandidatengene für die Rübenentwicklung und Saccharoseakkumulation in der Rübenwurzel zu identifizieren. Dies ist von besonderer Bedeutung für die Forschung an Zuckerrüben, weil diese Prozesse nicht in Modellpflanzen ohne ein Wurzelspeicherorgan für die Saccharose analysiert werden können.

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