Untersuchungen zur Assemblierung des ABC-Transporters Mdl1 in Mitochondrien von Saccharomyces cerevisiae

Galluhn, Dominik (2004). Untersuchungen zur Assemblierung des ABC-Transporters Mdl1 in Mitochondrien von Saccharomyces cerevisiae. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

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Abstract

Der ABC-Transporter Mdl1 ist in der inneren Mitochondrienmembran lokalisiert und vermittelt den Export von Peptiden, die bei der Proteolyse mitochondrialer Proteine durch die m-AAA-Protease erzeugt werden. Die biochemische Charakterisierung von Mdl1 und die Identifizierung von Bindungspartnern sollten Hinweise auf die Funktion des mitochondrialen Peptidexports in der Zelle geben. Mdl1 besitzt in Gegenwart von ATP ein natives Molekulargewicht von 250 kDa, während in Abwesenheit von ATP ein hochmolekularer Komplex von 850 kDa identifiziert werden konnte. Weitere Analysen zeigten, dass Mdl1 nach Zugabe von ATP einen homooligomeren, wahrscheinlich dimeren Komplex in der inneren Mitochondrienmembran bildet. Die Annahme, dass Mdl1 während des Peptidexports direkt mit der m-AAA-Protease in Wechselwirkung tritt, konnte nicht bestätigt werden. Die Isolierung des mit Mdl1 assoziierten hochmolekularen Komplexes mittels Affinitätschromatographie und die Analyse der Proteinkomponenten durch MALDI-Massenspektrometrie führten zur Identifizierung von Untereinheiten der F1FO-ATP-Synthase als Bindungspartner. Die Inaktivierung der m-AAA-Protease führt zum Verlust dieses hochmolekularen Komplexes. Die Ursache hierfür liegt in einer Beeinträchtigung des F1FO-Komplexes, da die Assemblierung des FO-Sektors primär von der proteolytischen Aktivität der m-AAA-Protease abhängig ist. Weitere Untersuchungen ergaben, dass die Wechselwirkung mit Mdl1 innerhalb der Membran über Untereinheiten des FO-Sektors in Abhängigkeit von der ATPase-Aktivität der ATP-Synthase erfolgt. Andererseits zeigen Nukleotidbindung und -hydrolyse von Mdl1 keinen Einfluss auf die Interaktion. Verschiedene Befunde deuten darauf hin, dass Mdl1 in einer inaktiven Form mit dem F1FO-Komplex in Wechselwirkung tritt. Obwohl bisher keine direkten Hinweise dafür gefunden wurden, könnte dies eine Regulation des Peptidexports durch Mdl1 in Abhängigkeit von der Aktivität der ATP-Synthase und somit der respiratorischen Aktivität der Zelle ermöglichen. Dies würde Vermutungen über eine Funktion von Mdl1 bei der Reaktion der Zelle auf oxidativen Stress entsprechen. Unter diesen Bedingungen kommt es vermehrt zum Abbau von Atmungskettenkomplexen und zum Verlust mitochondrialer DNA. Eine Aktivierung von Mdl1 infolge einer Beeinträchtigung der oxidativen Phosphorylierung könnte den erhöhten Exportbedarf nach Proteolyse von Atmungskettenkomponenten kompensieren. Hinweise auf eine Signalfunktion des Peptidexports durch Mdl1 zwischen Mitochondrien und Zellkern konnten bisher nicht gefunden werden. Andererseits führt der Verlust der i-AAA-Protease zu einer Beeinträchtigung des PDR-Signalweges.

Item Type:

Thesis (PhD thesis)

Translated title:

Title	Language
Assembly studies on the ABC transporter Mdl1 in mitochondria of Saccharomyces cerevisiae	English

Translated abstract:

Abstract

Language

The ABC transporter Mdl1 is localised in the inner membrane of mitochondria and mediates the export of peptides generated upon proteolysis of mitochondrial proteins by the m-AAA protease. Biochemical characterisation of Mdl1 and identification of binding partners should give information about the function of mitochondrial peptide export in the cell. In the presence of ATP Mdl1 has a native molecular weight of 250 kDa, whereas a high molecular weight complex of 850 kDa was identified in the absence of ATP. Further studies demonstrated the formation of a homooligomeric, probably dimeric complex of Mdl1 in the inner membrane of mitochondria after addition of ATP. A possible interaction between Mdl1 and the m-AAA protease during peptide export was not confirmed. Isolation of the complex associated to Mdl1 by affinity purification and analysis of protein components employing MALDI mass spectrometry led to the identification of subunits of the F1FO-ATP synthase as binding partners. Inactivation of the m-AAA protease caused the loss of the high molecular weight complex. This is due to an impairment of the F1FO-complex, as the assembly of the FO-sector depends on the proteolytic activity of the m-AAA protease. Further investigations revealed the binding of Mdl1 to the FO-sector in the membrane depending on the ATPase activity of the ATP synthase. In contrast, nucleotide binding and hydrolysis of Mdl1 did not affect this interaction. Various results led to the conclusion that the transporter bound to the F1FO-complex is inactive. Although there is no direct evidence this might allow the regulation of the peptide export via Mdl1 dependending on the activity of the ATP synthase and therefore on the respiratory activity of the cell. This would be in agreement with a possible role of Mdl1 in the response of the cell to oxidative stress. Under these conditions an increase in the degradation of respiratory chain complexes and loss of mitochondrial DNA occur. Activation of Mdl1 due to an impairment of oxidative phosphorylation could compensate an increased need for peptide export activity after proteolysis of respiratory chain subunits. Up to now there are no hints for a signal function of the peptide export by Mdl1. Although, loss of the i-AAA protease leads to an impairment of the PDR-signal pathway.

English

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