Universität zu Köln

Ley, Oliver Alexander (2005). Charakterisierung der Regulation des Prolinbiosyntheseweges in Corynebacterium glutamicum. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Corynebacterium glutamicum akkumuliert zum Schutz vor hyperosmotischem Stress kompatible Solute. Die bevorzugte osmoprotektive Substanz, die durch de-novo-Synthese akkumuliert wird, ist Prolin. Wird die Synthese von Prolin durch die Deletion von Genen des Prolinbiosyntheseweges verhindert, so synthetisiert C. glutamicum stattdessen Glutamin. Der Ersatz von Prolin durch Glutamin erlaubt dem Bakterium zwar auch eine Akklimatisation an hohe Osmolalitäten, die Wachstumsgeschwindigkeit, die bei der Akkumulation von Prolin als kompatiblem Solut gemessen werden kann, wird aber nicht erreicht. In dieser Arbeit konnte demonstriert werden, dass die Expressionskontrolle der Gene proA, proB und proC für den Aufbau eines hohen internen Prolinpools essentiell ist. Eine biochemische Aktivierung der kodierten Enzyme scheint nur in geringem Maße stattzufinden. Die Steigerung der Expression wird in Abhängigkeit von der externen Osmolalität reguliert und basiert auf einer de-novo-Synthese der mRNA. Durch unabhängig voneinander durchgeführte real-time-PCR und DNA-Microarray-Analysen konnten vergleichbare Faktoren für die Expressionssteigerung der Gene proA, proB und proC bestimmt werden. Mittels dieser Experimente konnte außerdem die Induktion von proC als Hauptregulationspunkt für die Einstellung der Prolinsyntheseleistung identifiziert werden. Bei der Untersuchung der Transkriptionskontrolle der drei Gene konnte die Beteiligung von alternativen Sigmafaktoren, zwei-Komponenten Systemen, veränderter mRNA-Stabilität und die stringente Kontrolle ausgeschlossen werden. Auch individuelle Transkriptionsfaktoren, die in der Promotorregion der Gene binden, konnten nicht identifiziert werden. Als möglicher Regulationsmechanismus sollte eine veränderte Aktivität der RNA-Polymerase in Betracht gezogen werden. Der interne Prolinpool wird in C. glutamicum durch die Synthese und den Export von Prolin eingestellt, da ein Abbau von Prolin nicht möglich ist. Durch einen Prolinpuls bei einer konstanten Osmolalität konnte außerdem gezeigt werden, dass die Transkription von Transportsystemen (ProP und PutP), die Prolin aufnehmen, reprimiert wird. Übereinstimmend war auch nur eine transiente Aufnahme von Prolin zu beobachten. Transportsysteme für andere kompatible Solute wie BetP unterlagen dieser Regulation nicht. Zusammenfassend konnte festgestellt werden, dass C. glutamicum Prolin nicht als Kohlenstoff- bzw. Stickstoffquelle verwenden kann, und die Akkumulation in der Zelle nur der Osmoprotektion dient.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language Characterisation of the regulation of proline biosynthesis in Corynebacterium glutamicum English
Translated abstract:	Abstract Language The Gram-positive soil bacterium Corynebacterium glutamicum accumulates compatible solutes in response to osmotic stress. Proline is the preferred osmoprotective substance which is accumulated by de-novo synthesis. The deletion of the proline biosynthesis genes proA or proC showed that C. glutamicum can partly replace prolin by the accumulation of glutamine. The impaired bacterial growth of the deletion strains under hyperosmotic conditions indicated that proline accumulation is important but not essential for osmoadaptation. It could be demonstrated that the induction of pro-gene expression is essential for the accumulation of high internal concentrations of proline. Nevertheless a slight increase in enzyme activity was detectable. The expression of the proline biosynthesis genes was studied by means of northern-blot hybridisations and showed an upregulation depending on the external osmolality. Using the two different approaches real-time-PCR and DNA-microarray-analysis the induction of pro-gene expression could be quantified. The prolonged induction of proC showed the importance of this gene for proline synthesis. The mechanism regulating the transcription of pro-genes is still unknown. It could be demonstrated that the transcription is independent of two-component systems, alternative sigma factors, stringent control and mRNA-stability. Furthermore no individual transcription factor of pro-gene transcription could be identified. A changed activity of the RNA polymerase under hyperosmotic conditions should be considered as possible regulatory mechanism. The internal pool of proline is controlled by the synthesis and the export of proline. A degradation of proline was not observed in C. glutamicum. Furthermore genes for proline uptake systems (ProP and PutP) are repressed by externaly added proline in case of isoosmotic conditions. Genes encoding uptake systems for other compatible solutes e.g. BetP are not affected by this regulation. Proline cannot be used as carbon or nitrogen source. The major purpose of proline uptake in C. glutamicum is osmoprotection. English
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Ley, Oliver Alexander o.ley@uni-koeln.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-14047
Date:	2005
Language:	German
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Chemistry > Institute of Biochemistry
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language corynebakterium , glutamicum , prolin , biosynthese , transkription German proline , biosynthesis , corynebacterium , glutamicum , transcription English
Date of oral exam:	2 February 2005
Referee:	Name Academic Title Krämer, Reinhard Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/1404