Characterisation of Dof, an essential adaptor molecule in fibroblast growth factor signalling in Drosophila melanogaster

Csiszar, Agnes (2005). Characterisation of Dof, an essential adaptor molecule in fibroblast growth factor signalling in Drosophila melanogaster. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

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Abstract

The FGF signal transducer molecule Dof has been shown to act upstream of the Ras-MAPK pathway. It is unknown how Dof transmits the signal from the activated FGF receptor to the MAPK cascade. Several approaches were taken to analyse this mechanism. 1. One way to resolve this question is to analyse Dof mediated interactions. In this work interaction of Dof with selected candidates of a yeast two hybrid screen was analysed biochemically. Most but not all of the tested candidates were able to form a complex with Dof in Drosophila S2 cells. The predicted capability of Dof for self-association was validated by showing that the molecule was able to form dimers/oligomers in S2 cells. Co-immunoprecipitation studies of Dof with the FGF receptor Heartless showed that the DBB domain - an essential region of the molecule needed for dimerisation and shared with BCAP and BANK - is required for efficient receptor binding. A consensus sumoylation site is located within the DBB domain of Dof. Mutation of this site impaired binding to the FGF receptor Heartless. Dof interacted with the SUMO conjugating enzyme Ubc9 and was sumoylated in Drosophila S2 cells suggesting that SUMO modification of the molecule might regulate interaction with the FGF receptor. 2. As a second approach phosphorylation of Dof was analysed that might influence the activity of the protein in signal transmission. Dof becomes phosphorylated in the presence of an activated FGF receptor at the conserved tyrosine motifs for PI3K and Csw binding. In addition, we identified a novel tyrosine motif as a phosphorylation target which appears four times in Dof. Strikingly, it is also present in BANK and some other signalling molecules. The C-terminal part of Dof is also phosphorylated and might be involved in conformational regulation of the protein, since the removal of the last 200 amino acids improved the binding affinity of Dof to Heartless. 3. Dof is cleaved in Drosophila S2 cells, which might give an additional level in the regulation of signalling. This cleavage is caspase dependent, regulated by Dronc and requires an intact caspase cleavage site in Dof. However, a Dof transgene mutant for the caspase cleavage site rescued efficiently dof mutant phenotypes indicating that this site is not essential for Dof functions assayed in this work. Mutant Dof constructs with C-terminal truncations of different lengths that removed the caspase cleavage site varied in their expression levels despite their similar stability in S2 cells. These differences were not seen in mRNA abundance but only in protein levels and higher expression levels correlated with the presence of a region in Dof identified as a binding site for the ribosomal protein S10. Full length Dof showed expression levels comparable to that of the mutant construct lacking the ribosomal protein binding site. Thus, this is the first indication that Dof cleavage products might have additional roles in the regulation of Dof function. 4. One essential function of Dof is to activate the Ras-MAPK pathway in vivo. To find out if only the MAPK signalling panel is utilised by Ras activity the role of the three Ras effectors Raf, RalGDS and PI3K were determined in FGF signalling during Drosophila embryogenesis. This analysis showed that both the Raf and RalGDS effector pathways might have a function in FGF signalling but that additional Ras activity is required either to regulate these cascades or to turn on other effector pathways. Our results indicate that PI3K is not needed for FGF signal transduction. In addition to Ras, Rap1 might be also involved in FGF signalling downstream or in parallel to Dof. How Rap1 is activated and to what extent the two closely related Ras family GTPases share downstream effectors is not understood at present.

Item Type:

Thesis (PhD thesis)

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Title	Language
Charakterisierung von Dof, einem essentiellen Adapter-Molekül in FGF Signaltransduktionsweg bei Drosophila melanogaster	German

Translated abstract:

Abstract

Language

Es wurde gezeigt, dass Dof, ein mögliches Adapter-Molekül, im FGF-Signalweg überhalb der Ras-MAPK Signalkaskade agiert. Es ist aber unbekannt wie Dof das Signal vom aktivierten FGF-Rezeptor zu der MAPK-Kaskade weiterleitet. In dieser Arbeit wurden verschiedene Strategien angewendet, um diesen Mechanismus zu analysieren. 1. Eine Möglichkeit diese Frage zu adressieren ist die Analyse der molekularen Interaktionen von Dof mit anderen Proteinen. In dieser Arbeit wurden die Interaktionen von Dof mit ausgewählten Kandidaten, die in einem Hefe-2-Hybrid Screen gefunden wurden, biochemisch untersucht. Die meisten dieser Kandidaten können in Drosophila S2 Zellen Komplexe mit Dof bilden. Die vorausgesagte Fähigkeit von Dof, Komplexe mit sich selbst einzugehen, wurde in S2 Zellen nachgewiesen. Ko-Immunopräzipitations-Untersuchungen mit Dof und dem FGF-Rezeptor Heartless zeigten, dass die DBB Domäne von Dof -eine essentielle Region, die nötig für Dimerisation ist und auch in den Proteinen BCAP und BANK vorhanden ist- notwendig für eine effiziente Bindung an den Rezeptor ist. Innerhalb der DBB Domäne von Dof liegt eine konservierte SUMOlations Stelle. Mutationen dieser Stelle verhindern die Bindung von Dof an Heartless. Dof interagiert mit Ubc9, einem SUMO konjugierenden Enzym, und wird in S2 Zellen SUMOliert. Eine SUMOlation von Dof könnte also die Interaktion mit dem Rezeptor regulieren. 2. Die Phosphorylierung von Dof könnte die Aktivität des Proteins bei der Signalübertragung beeinflussen. Dof wird an den konservierten Tyrosin-Motiven für die Bindung von PI3K und Csw phosphoryliert wenn ein aktivierter Rezeptor vorhanden ist. Zusätzlich haben wir ein neues Tyrosin-Motif gefunden, welches viermal in Dof vorhanden ist und auch in BANK und anderen Signal-Molekülen präsent ist. Der C-Terminus wird ebenfalls phosphoryliert und könnte bei der Regulation der Konformation notwendig sein, da die Deletierung der letzten 200 Aminosäuren am C-Terminus die Bindung von Dof an Heartless verbessert. 3. Dof wird in S2 Zellen kaspaseabhängig gespalten. Dies könnte eine weitere Stufe der Regulation des Signalweges sein. Diese Spaltung wird durch Dronc reguliert und benötigt eine intakte Kaspasen-Spaltungsstelle in Dof. Ein Dof-Transgen, in dem diese Stelle mutiert ist, rettet jedoch effizient den dof Phänotyp in Drosophila. Dies deutet darauf hin, dass diese Stelle nicht essentiell für die Funktion von Dof ist, die in dieser Arbeit analysiert wurde. Konstrukte, bei denen der C-Terminus in verschiedenen Längen, aber immer mit der Kaspasen-Spaltungsstelle, deletiert wurde, unterscheiden sich in ihrer Expressionsstärke, obwohl sie ähnlich stabil in S2 Zellen sind. Diese Unterschiede konnten nur auf Protein-Ebene, aber nicht auf mRNA-Ebene gesehen werden und die stärkere Expression korrelierte mit der Anwesenheit einer Bindungsstelle für das ribosomale Protein S10 in der Proteinsequenz von Dof. Die Expressionsstärke des kompletten Dof-Konstruktes entspricht den Deletions-Konstrukten, in denen diese Bindungsstelle fehlt. Dies ist der erste Hinweis, dass Spaltungsprodukte von Dof zusätzliche Funktionen bei der Regulation von Dof haben. 4. Die Aktivierung des Ras-MAPK Signalweges ist eine essentielle Funktion von Dof in vivo. Es wurde untersucht ob die Ras-Aktivität nur die MAPK-Kaskade aktiviert. Hierzu wurde die Rolle der drei Ras Effektoren Raf, RalGDS und PI3K innerhalb des FGF-Signalweges während der Embryogenese von Drosophila untersucht. Die Raf und RalGDS Signalwege könnten eine Funktion in der FGF-Signalkaskade haben, aber zusätzliche Ras-Aktivität ist notwendig um diese oder andere Effektor-Signalwege zu aktivieren oder regulieren. PI3K hingegen wird für den FGF-Signalweg nicht benötigt. Zusätzlich zu Ras könnte auch Rap1 in den FGF-Signalweg involviert sein - abwärts oder parallel zu Dof. Wie Rap1 aktiviert wird und in wieweit diese beiden nah verwandten GTPasen der Ras Familie ihre Signalwege teilen ist zurzeit nicht bekannt.

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