Die Regulation und Aktivierung von Matrix Metalloproteinasen durch Interaktionen von humanen Melanomzellen mit dermalen Fibroblasten und mikrovaskulären Endothelzellen

Löffek, Stefanie (2005). Die Regulation und Aktivierung von Matrix Metalloproteinasen durch Interaktionen von humanen Melanomzellen mit dermalen Fibroblasten und mikrovaskulären Endothelzellen. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

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Abstract

In dieser Arbeit konnte mit Hilfe eines in-vitro-Kokultur-Systems gezeigt werden, dass hoch invasive Melanomzellen der Linie BLM hauptsächlich über die Abgabe löslicher Faktoren die proMMP-1- und proMMP-3-Synthese in primären dermalen Fibroblasten induzieren können. Wenig invasive Melanomzellen der Linie WM164 hingegen zeigen keinen Effekt auf die Synthese dieser Proteasen in Fibroblasten. Der Einsatz neutralisierender Antikörper gegen Zytokine und Wachstumsfaktoren sowie des rekombinanten IL-1RA zeigten, dass IL-1a und bFGF maßgeblich an der Interaktion zwischen BLM Melanomzellen und Fibroblasten und der damit verbundenen Induktion der MMP-1-Synthese beteiligt waren. Die gleichzeitige Inhibition der IL-1- und bFGF-Signaltransduktion zeigte allerdings, dass neben IL-1a und bFGF weitere Faktoren als Mediatoren in dieser Interaktion involviert sind. Aus diesen Ergebnissen ergab sich die folgende Arbeitshypothese für die Kommunikation der Zellen in vivo: hoch invasive Melanomzellen induzieren über die Abgabe löslicher Faktoren, IL-1a, bFGF und anderer noch nicht identifizierter Faktoren, die Synthese von MMPs, insbesondere der humanen Kollagenase MMP-1, in stromalen Fibroblasten. Dadurch wird die perizelluläre Proteolyse des interstitiellen Bindegewebes eingeleitet, welches die Invasion von Melanomzellen in die Dermis erleichtert. Weiterhin wurde ein Mausmodell etabliert, in dem die Ausbildung von Tumoren und das Vorhandensein von Organmetastasen nach intradermaler Injektion von hoch invasiven humanen BLM Melanomzellen gezeigt werden konnte. Die Behandlung dieser Tiere mit dem rekombinanten humanen IL-1RA hatte keinen Effekt auf die Bildung des Tumors, verhinderte jedoch die Metastasierung in innere Organe. Dies deutet darauf hin, dass IL-1 eine bedeutende Rolle in der Metastasierung über das Lymph- und Blutsystem spielt. Unklar ist derzeit, ob die Inhibition der Metastasierung direkt auf die Blockade der Synthese von interstitiellen Kollagenasen zurückzuführen ist, oder ob die IL-1RA-Applikation andere Kommunikationswege wie z.B. die Expression von Chemokinen bzw. ihrer Rezeptoren beeinflusst. Der zweite Teil der Arbeit befasste sich mit den molekularen Mechanismen die der Interaktion zwischen Melanomzellen und Endothelzellen zugrunde liegen. Die Kokultivierung der Melanom- und mikrovaskulären Endothelzellen unter den Bedingungen der Monolayerkultur zeigte keine Veränderungen in der Zellmorphologie und der Synthese von MMPs in Endothelzellen. Endothelzellen, die auf einer dreidimensionalen Fibrinmatrix kultiviert wurden bildeten dagegen in Gegenwart von BLM-konditioniertem Medium tubuläre Strukturen aus und zeigten eine vermehrte Migration in diese Matrix. Konditioniertes Medium der wenig invasiven WM164 Melanomzellen hatte dagegen keinen Einfluss auf Morphologie und Migration der Endothelzellen. Diese Befunde weisen darauf hin, dass Endothelzellen zum einen den Kontakt zu einer dreidimensionalen Matrix, z.B. Fibrin oder Kollagen, benötigen und zum anderen, dass die Expression von Proteasen für die Invasion wesentlich ist. Inhibitionsstudien mit VEGF neutralisierender Antikörpern und dem MMP-Inhibitor Phenanthrolin machten deutlich, dass sowohl VEGF als auch MMPs bei der Induktion tubulärer Strukturen involviert sind. Die erhöhte Proliferation und Differenzierung der Endothelzellen ist abhängig von VEGF, welches in erhöhten Mengen von Melanomzellen sezerniert wird. Dieser Wachstumsfaktor induziert die Synthese von MT1-MMP und könnte somit zur vermehrten Degradation der Fibrinmatrix führen. Das Verständnis der hier analysierten molekularen Mechanismen stellt eine grundlegende Basis zur Entwicklung neuer Therapien zur Behandlung maligner Melanome dar, die nicht nur die Tumorzellen selbst, sondern auch das peritumorale Stroma als Ansatzpunkt für ein gezieltes Eingreifen in die Invasion und Metastasierung von Tumorzellen einbeziehen.

Item Type:

Thesis (PhD thesis)

Translated abstract:

Abstract

Language

By using an in vitro co-culture system we could show that soluble factors, derived from high invasive BLM melanoma cell can induce proMMP-1 and proMMP-3 synthesis by dermal fibroblasts. In contrast, the low invasive WM164 melanoma cells had no effect on protease synthesis by fibroblasts. Using neutralising antibodies against cytokines and growth factors, as well as recombinant IL-1RA we could identify IL-1a and bFGF as the main mediators in the communication between melanoma cells and fibroblasts. However, while proMMP-1 synthesis was strongly inhibited the inhibition of both factors, IL-1a and bFGF failed to completly abolish proMMP-1 synthesis in dermal fibroblasts, indicating that additional factors are involved in this cross-talk. Therefore we would suggest, that in vivo soluble factors derived by melanoma cells induce stromal production of proteases leading to pericellular degradation of the connective tissue and invasion of melanoma cells into the underlying tissue. Using a mouse model we could demonstrate the formation of a tumour and the appearance of lung metastasis, after intracutaneous injection of high invasive melanoma cells. Animals treated with the recombinant IL-1RA after inoculation of invasive melanoma cells, failed to develope lymphnode or organ metastasis. In the second part of the work, we provide data on the analysis of the molecular mechanisms of tumour-induced angiogenesis. While we observed no obvious differences in cell morphology in dermal microvascular endothelial cells (HDMECs) upon direct co-culture with high invasive BLM melanoma cells, HDMECs grown on a three dimensional fibrin matrix formed vessel-like structures when treated with medium conditioned by high invasive melanoma cells. In addition, we could observe induced migration of endothelial cells into the underlying matrix and formation tubular structures. In contrast medium conditioned by low invasive WM164 cells failed to induce these cellular alterations. Treatment with neutralising antibodies against VEGF and with the MMP inhibitor phenanthroline suggested that VEGF and MT1-MMP are involved in the induction of tube formation. In summary, we could show that HDMECs need firstly the contact to a three-dimensional matrix, e.g. fibrin or collagen, and, secondly, expression of proteases for tube formation. The proliferation and the differentiation of HDMECs is dependent on VEGF produced at increased amounts by high invasive melanoma cells. This growth factor may regulate proteases expression, namely MT1-MMP, necessary for degradation the fibrin matrix and the migration of the endothelial cells into this matrix. In support of this hypothesis, treatment with recombinant VEGF of HDMECs monoculture, in absence of specific matrix interactions, induces up-regulation of MT1-MMP transcripts. These studies provide insights into the basic mechanisms of tumour-stroma interactions. This knowlege might help to develope new straragies in the treatment of malignant melanoma by using the stroma as an alternative target for therapy.

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