Universität zu Köln

London, Markus Konrad Justin (2004). Regulation der Proteasombiogenese in Saccharomyces cerevisiae. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Selektive Ubiquitin (Ub)-vermittelte Proteolyse ist der wichtigste Mechanismus im Abbau zytosolischer und nukleärer Proteine eukaryotischer Zellen. Substratproteine werden durch Komponenten des Ub-Systems erkannt und über interne Lysinreste mit Polyubiquitinketten verknüpft. Diese Polyubiquitinketten vermitteln die Bindung an das 26S-Proteasom, einem Komplex mit einer Masse von ca. 2MDa, der die Substratproteine entfaltet und hydrolysiert. Die Expression proteasomaler Gene wird durch einen autoregulatorischen Mechanismus in Abhängigkeit von der proteasomalen Aktivität reguliert. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass der Transkriptionsfaktor Rpn4 neben der basalen Expression die aktivitätsabhängige Expression proteasomaler Gene und des Polyubiquitin-Gens kontrolliert. Die Deletion von RPN4 verursachte eine Reduktion der proteasomalen Aktivität um 50% und führte in Zellen, in denen die Aktivität oder die Assemblierung der Proteasomen beeinträchtig war, zur Ausprägung starker Wachstumsdefekte. Die Analyse der Stabilität von Rpn4 in verschiedenen proteasomdefizienten Stämmen zeigte, dass Rpn4 selber ein Substrat des proteasomalen Proteinabbaus ist. Dies bewirkt eine direkte Abhängigkeit der Rpn4-Menge von der proteasomalen Aktivität in der Zelle, die eine Korrelation dieser Aktivität mit der Rpn4-kontrollierten Neusynthese von Proteasomen ermöglicht. Rpn4 ist ein ungewöhnliches Substrat des Proteasoms, das durch von Ubiquitin-abhängigen und -unabhängigen Mechanismen abgebaut wird. Durch ein selektionsbasiertes "Screening"-Verfahren konnten die Mutanten dor2 und dor3 (degradation of Rpn4) isoliert werden, die den Abbau von Rpn4 beeinträchtigen. In der dor2-Mutante scheint das Gen FHL1 betroffen zu sein, das für einen Transkriptionsfaktor kodiert, der an der Prozessierung ribosomaler RNA beteiligt ist. Die Identität des durch dor3 betroffenen Genes ist noch unbekannt, jedoch konnte gezeigt werden, dass hier spezifisch der Ubiquitin-abhängige Abbau von Rpn4 gestört ist. Neben der Kontrolle der Expression proteasomaler Gene ist Rpn4 auch Teil eines Netzwerks, das die zelluläre Antwort auf unterschiedliche Stressbedingungen reguliert, die die Beseitigung von DNA-Schäden einschließt. Die Auswirkungen von Substanzen, die solchen Stress hervorrufen, wurden am Beispiel von Methylmethansulfonat (MMS) und Koffein untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die Zugabe von MMS zu einer Steigerung der RPN4-Genexpression führt, während die Zugabe von Koffein zu einem raschen Abbau von Rpn4 führt. Die Deletion von RPN4 führte zu einer starken Sensitivität gegen beide Substanzen. Die Überexpression der Gene YAP1 oder SSZ1, für die eine Funktion in der zellulären Antwort auf verschiedene Stressbedingungen beschrieben ist. bewirkte eine Suppression dieser Sensitivität. Die Analyse der Mechanismen, die der Regulation von Rpn4 zugrunde liegen, könnte zu interessanten Einblicken in das Zusammenspiel zwischen dem Ubiquitin/Proteasom-System und der zellulären Stressantwort führen.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language Regulation of Proteasome Biogenesis in Saccharomyces cerevisiae English
Translated abstract:	Abstract Language Selective ubiquitin (Ub)-mediated proteolysis is the dominating mechanism in the degradation of cytosolic and nuclear proteins in eukaryotic cells. Substrate proteins are recognized by enzymes of the Ub-system, and poly-Ub-chains are attached to internal lysine residues. These poly-Ub-chains mediate interaction with the 26S-proteasome, a ~2MDa complex that unfolds and degrades the substrate proteins. Expression of proteasome subunit genes is regulated by an autoregulatory mechanism in dependence of proteasome activity. In this work it is shown that the transcriptional activator Rpn4 controls basal as well as activity dependent expression of proteasome subunit genes and of the polyubiquitin gene. Deletion of RPN4 resulted in a reduction of proteasome activity by 50% and led to severe growth defects in combination with mutants interfering with proteasome activity or assembly. Analysis of Rpn4 stability in different proteasome deficient mutants revealed that Rpn4 itself is a substrate of the proteasome which directly links Rpn4 abundance to the activity of the proteasome. This enables the cell to correlate proteasome activity and Rpn4 dependent de novo synthesis of proteasome complexes. Rpn4 is an unusual substrate of the proteasome that is degraded by ubiquitin-dependent and -independent mechanisms. A selection based screen for mutants stabilizing Rpn4 led to the isolation of dor2 and dor3 (degradation of Rpn4). The dor2 mutation seems to affect the FHL1 gene that encodes a transcription factor involved in ribosomal RNA processing. The identity of the gene affected by dor3 is currently unknown, but it could be shown that the mutation results in an impaired ubiquitin-dependent degradation of Rpn4. In addition to regulating proteasome subunit gene expression, Rpn4 is also part of a regulatory network controlling cellular responses to a variety of stresses including DNA-damage. In the present work the effects of two substances that induce such stresses were analyzed. It could be shown that addition of the DNA-damaging drug methyl methanesulfonate (MMS) leads to an increase in RPN4 gene expression while addition of caffeine induces a more rapid turnover of Rpn4 protein. The deletion of Rpn4 resulted in a strong sensitivity against MMS and caffeine. Overexpression of the YAP1 or SSZ1 gene suppressed this hypersensitivity. Both genes are known to act in cellular responses to various stresses. Analysis of the mechanisms underlying the regulation of Rpn4 could reveal interesting insights into the interplay between the ubiquitin/proteasome-system and cellular responses to a variety of different stresses. English
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code London, Markus Konrad Justin m.london@uni-koeln.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-14452
Date:	2004
Language:	German
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Biology > Institute for Genetics
Subjects:	Life sciences
Date of oral exam:	29 November 2004
Referee:	Name Academic Title Dohmen, R. Jürgen Pof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/1445