Das E6-Onkoprotein humaner Papillomviren und seine Wechselwirkung mit E6AP als Zielstruktur für eine molekulare Therapie zervikaler Karzinome

Kuballa, Petric (2004). Das E6-Onkoprotein humaner Papillomviren und seine Wechselwirkung mit E6AP als Zielstruktur für eine molekulare Therapie zervikaler Karzinome. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

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Abstract

Bestimmte Typen humaner Papillomviren (´high risk´ HPVs) spielen bei der Entstehung des Zervixkarzinoms eine kausale Rolle. Dabei scheint die Expression der viralen Proteine E6 und E7 in allen Stadien der Karzinogenese essentiell zu sein. E6 besitzt anti-apoptotisches Potential, das vermutlich zur Kompensation einer E7-vermittelten Apoptose-Sensitivität infizierter Zellen benötigt wird. Für E6 sind potentielle Wechselwirkungen mit einer Vielzahl von zellulären Proteinen beschrieben, wobei die physiologische Relevanz für die meisten Interaktionen weitestgehend unbekannt ist. In dieser Arbeit wurden mutierte Formen von E6 durch gezielte Mutagenese generiert und jeweils in ihren Wechselwirkungen mit dem Tumorsuppressor p53, der Protein-Ubiquitin-Ligase E6AP und den PDZ-Proteinen Scribble und Dlg charakterisiert. Dabei wurden Beobachtungen gemacht, die auf einen E6AP-vermittelten Abbau von Dlg durch E6 hinweisen und somit im Widerspruch zu publizierten Daten stehen. Dies ist aber vermutlich dadurch zu erklären, dass in vorherigen Studien ein Abbau von Dlg durch Formen von E6, die sich von ´low risk´ E6 Proteinen ableiten, beobachtet wurde. Da diese E6 Formen nicht in der Lage sind, E6AP in vitro zu kopräzipitieren, wurde geschlussfolgert, dass sie nicht mit E6AP interagieren. Durch die Verwendung von E6AP -/- Mausfibroblasten konnten in dieser Arbeit allerdings deutliche Hinweise für eine Interaktion von E6AP mit dem E6 Protein des ´low risk´ HPV-Typen 11 gefunden werden. Zusätzlich wurde das onkogene Potential der generierten E6 Mutanten in Zellkulturstudien untersucht. Vorläufige Ergebnisse zeigen an, dass dem extremen C-Terminus von ´high risk´ E6 Proteinen eine wichtige Rolle bei der Immortalisierung von Zellen zukommt. Um diesen Einfluss des C-Terminus näher zu spezifizieren, ist die Generierung weiterer E6 Mutanten notwendig. Um zu untersuchen, ob die Interaktion von E6 mit E6AP eine potentielle Zielstruktur für molekulare Ansätze bei der Behandlung des Zervixkarzinoms darstellt, wurde die Methode der Proteintransduktion etabliert. Dazu wurde das von E6AP-abgeleitete E6-Bindepeptid e6bp1 an ein zellpenetrierendes Peptid (im vorliegenden Fall ´ARG7´) fusioniert und es konnten alle wesentlichen Eigenschaften von zellpenetrierenden Peptiden beobachtet werden. Allerdings wurden alle Untersuchungen unter Bedingungen durchgeführt, für die kürzlich die Möglichkeit der Erzeugung von Artefakten beschrieben wurde. Daher sind weitere Untersuchungen nötig, um Aussagen über einen Einfluss von e6bp1 auf das Wachstum von HPV-positiven Zellen treffen zu können.

Item Type:

Thesis (PhD thesis)

Translated abstract:

Abstract

Language

Certain types of human paillomaviruses (´high risk´ HPVs) play a causal role in the development of cervical cancer. The expression of the viral proteins E6 and E7 seems to be essential in all phases of carcinogenesis. E6 has anti-apoptotic potential, which has been proposed to compensate an E7-mediated sensitivity of infected cells towards apoptosis. For E6, a number of potential cellular interacting proteins has been described, but the physiological relevance of most of these interactions remains poorly understood. In this study, a panel of mutated forms of E6 was generated by site-directed mutagenesis and their potential to interact with the tumour suppressor p53, the ubiquitin ligase E6AP and the PDZ-proteins Scribble and Dlg respectively, was determined. The results obtained indicate that Dlg is degraded by E6 in an E6AP-dependent manner, which is in contrast to published data. A possible explanation for this difference is provided by the notion that, in previous studies, it was demonstrated that Dlg can be degraded in cells by forms of E6, which are derived from ´low risk´ E6 proteins. These forms of E6 do not co-precipitate E6AP in vitro, and thus it was concluded that they do not interact with E6AP. However, in the present study evidence for a functional interaction of E6AP and the E6 protein of the low risk HPV-type 11 was obtained by the use of E6AP -/- fibroblasts. In addition, the oncogenic activity of the various mutated E6 proteins was tested in cell culture experiments. Preliminary results indicate that the very C terminus of ´high risk´ E6 proteins is necessary to induce an immortalization of primary keratinocytes. To further specify the role of the C terminus in immortalization, the generation of additional E6 mutants is necessary. To study if the interaction of E6 and E6AP provides a potential target for a molecular therapy of cervical cancers, the method of protein transduction was established. For this purpose, the E6AP-derived E6 binding peptide e6bp1 was fused to a cell penetrating peptide (´ARG7´ was used in this work) and all essential properties of cell penetrating peptides were observed. However, the data were generated under conditions that have recently been described to be prone to artefacts. Thus, further work will be required to study the possible interference of e6bp1 with the growth of HPV-positive cells.

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