Universität zu Köln

Vreden, Sebastian (2005). Expressionscharakterisierung und Identifizierung tumorrelevanter Gene beim humanen hepatozellulären Karzinom. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Das hepatozelluläre Karzinom (HCC) zählt zu den häufigsten Tumorerkrankungen weltweit. In etwa 80% der Fälle liegt der Hepatokarzinogenese eine chronische Lebererkrankung mit einer definierten Ätiologie, wie z.B. chronische Infektionen mit den Hepatitis-Viren B und C (HBV, HCV), zu Grunde. Die molekularen Mechanismen, die zur Entstehung von HCCs vor dem Hintergrund einer meist zirrhotisch veränderten Leber führen, sind nur unzureichend verstanden. Eine molekulare Subtypisierung des HCC von potentiell mechanistischer und therapeutischer Bedeutung konnte bisher nicht erzielt werden. In der vorliegenden Arbeit wurden 43 verschiedene humane HCC-Proben und drei HCC-Zelllinien im Vergleich mit gesunder, adulter Leber mit Hilfe von cDNA-Microarrays untersucht. Dreiundfünfzig Gene konnten identifiziert werden, die HCCs mit starker Differenzierung (Differenzierungsgrad G1) von solchen mit geringer Differenzierung (G3) unterscheiden, z.B. Histon-deacetylase 2 (HDAC2), Nucleolin (NCL), oder seven in absentia homologue-1 (Siah-1). Die Gruppierungs-(cluster-) analyse der Microarray-Daten der HCCs und der Zelllinien nach Genen mit den stärksten Expressionsunterschieden innerhalb der Tumoren ergab eine Unterteilung in zwei Hauptgruppen (benannt Gruppe A (65%) und Gruppe B (35%)). Die HCCs der Gruppe A waren durch die Induktion einer Reihe Interferon-regulierter Gene charakterisiert, während die Gruppe B hauptsächlich durch die Reduktion der Expression einiger apoptoserelevanter und Interferon-regulierter Gene charakterisiert war. Auf zellulärer Ebene konnte mit Hilfe von immunhistochemischen Färbungen gezeigt werden, dass die Zahl der apoptotischen Zellen und die Zahl Tumor-infiltrierender Lymphozyten in den Tumoren der Gruppe A im Vergleich zu denen der Gruppe B signifikant höher war. Die Gruppe B konnte aufgrund ihres Expressionsmusters in zwei weitere Untergruppen (bezeichnet als Subgruppe B1 (sechs von 43 Tumoren, 14%) und Subgruppe B2 (neun von 43 Tumoren, 21%)) unterteilt werden. Ein Hauptcharakteristikum der Subgruppe B1 war die hohe Überexpression von Insulin-like growth factor II (IGF-II). Alle getesteten HCC-Zelllinien exprimierten vergleichbar hohe Konzentrationen des dem fötalen Expressionsmuster von IGF-II entsprechenden Transkripts und gruppierten in der cluster-Analyse zusammen mit den Tumoren der Subgruppe B1. Die IGF-II-Überexpression schloss auch dann noch die Induktion Interferon-regulierter Gene aus, als die Untersuchungen auf Analysen der Expressionsprofile anderer Tumor-Entitäten ausgedehnt wurden. Zudem wurde die IGF-II-Expression in HCC-Zelllinien durch deren Behandlung mit Interferon  signifikant reduziert. Insgesamt zeigen die Ergebnisse der cDNA-Microarray-Analyse eine Subtypisierung des HCC auf, die mit der intratumorösen Inflammation und der Tumorzellapoptose assoziiert ist. Diese Expressionsanalyse könnte sowohl für die Entstehung als auch für die Therapie von HCC von Bedeutung sein, da die Überexpression von IGF-II bereits mit einer reduzierten Apoptose und einer erhöhten Proliferation in Verbindung gebracht wurde und einen möglichen Ansatzpunkt für einen therapeutischen Eingriff darstellt. Der zweite Schwerpunkt dieser Arbeit war die Untersuchung der Rolle von Stathmin in der Hepatokarzinogenese. Stathmin, ein zytoplasmatisches Phosphoprotein, das u.a. über die Kontrolle der Stabilität von Mikrotubuli mit dem Zellzyklus assoziiert ist, wurde in der cDNA-Microarray-Analyse in allen HCCs überexprimiert. Die Untersuchung der Transkriptmenge mit Hilfe der real-time-PCR ergab, das Stathmin in 38% der HCCs (13 von 34 Tumoren) im Vergleich zur normalen Leber um mindestens den Faktor zwei hochreguliert war. Auf Proteinebene konnte mit Hilfe von multi tissue microarrays eine hochsignifikante Korrelation der Zunahme und Häufigkeit der Expression von Stathmin mit der Entdifferenzierung der HCCs nachgewiesen werden. Eine solche Korrelation konnte ebenfalls für die Expression des Proliferationsmarkers Ki-67 sowie für p53 gezeigt werden. Die Analyse der Proteinexpression von Stathmin in einer Reihe von Zelllinien zeigte eine Verbindung zum Expressionsstatus von p53 auf. Zelllinien, die die Wildtyp-Form des p53 exprimieren, zeigten keine Expression des Stathmins. Eine deutliche Steigerung der Expression von Stathmin in Zelllinien konnte jedoch beobachtet werden, wenn das p53-Gen hingegen mutiert oder deletiert vorlag. Dies ist ein deutlicher Hinweis darauf, dass p53 die Expression von Stathmin beeinflusst. Stathmin scheint, wie bereits für andere Tumorentitäten gezeigt werde konnte, auch im HCC ein wichtiger Faktor bei der Entdifferenzierung und Proliferation zu sein. Durch seine wichtige Rolle in der Mitose stellt es eine interessante Zielstruktur für einen therapeutischen Ansatz dar.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language Expression Characterisation and Identification of Tumour relevant Genes of the Human Hepatocellular Carcinoma English
Translated abstract:	Abstract Language The hepatocellular carcinoma (HCC) is one of the most common tumours worldwide. 80% are based on a chronic liver disease with a defined aetiology, e.g. chronic infections with hepatitis virus B or C (HBV, HCV). The molecular mechanisms leading to the development of HCCs, generally on the background of a cirrhotic liver, are not well understood. Molecular subtyping of human HCC with potential mechanistic and therapeutic impact has not been achieved so far. We have analysed the mRNA expression patterns of 43 different human HCC samples and three HCC cell lines in comparison to normal adult liver using high-density cDNA microarrays. Fifty-three genes were identified which discriminated HCCs of differentiation grade G1 from grade G3 tumours, e.g. histone deacetylase 2 (HDAC2), nucleolin (NCL), or seven in absentia homologue-1 (Siah-1). Two main groups of HCCs designated group A (65%) and group B (35%) were distinguished by clustering the most highly varying genes. Group A HCCs were characterised by induction of a number of interferon-regulated genes, whereas group B was mainly characterised by down-regulation of several apoptosis-relevant and interferon -regulated genes. The number of apoptotic tumour cells and tumour infiltrating lymphocytes was the significantly higher in tumours of group A as compared with group B. Based on the expression pattern group B was further subdivided into two subgroups (designated subgroup B1 (six of 43 tumours, 14%) and subgroup B2 (nine of 43 tumours, 21%)). A prominent characteristic of subgroup B1 was high over-expression of IGF-II. All tested HCC-cell lines equally expressed high concentrations of IGF-II transcripts and co-segregated with group B1 in clustering. IGF-II over-expression was mutually exclusive to induction of IFN-related genes even when analysis was extended to other cancer expression profile studies. Moreover, interferon  treatment significantly reduced IGF-II expression in HCC-cells. In conclusion, cDNA microarray analyses provided a method for subtyping of HCCs that is related to intra tumorous inflammation and tumour cell apoptosis. This profiling may be of mechanistic and therapeutic impact, since IGF-II over-expression has been linked to reduced apoptosis and increased proliferation and may be accessible to therapeutic intervention. Another gene being differentially expressed in a number of HCCs is stathmin. The expression of this ubiquitously expressed cytosolic protein is altered in a number of malignancies such as ovariar, mamma or prostate carcinomas. It is an important factor during cell mitosis as it is responsible for the polymerisation and de-polymerisation of microtubules. Semiquantitative real time PCR of 34 tumours showed an increase of stathmin expression (at least of factor two) in 38% of the tumours (13 of 34 tumours). Increase in expression correlates with the de-differentiation of HCCs, proliferation (Ki-67), and expression of mutated p53. The analysis of stathmin expression in various cell lines demonstrated the repression of stathmin if wild-type p53 is present. Stathmin seems to be a critical factor for de-differentiation and proliferation of HCC. It might prove as an ideal target for chemotherapeutic attempt in combination with other substances aiming at microtubules to prevent tumour growth. English
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Vreden, Sebastian s.vreden@web.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-15000
Date:	2005
Language:	German
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Biology > Institute for Genetics
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language cDNA-Microarray , hepatozelluläres Karzinom , IGF-II, Stathmin , Differenzierung German cDNA microarray , hepatocellular carcinoma , IGF-II, stathmin, differentiation English
Date of oral exam:	15 June 2005
Referee:	Name Academic Title Brüning, Jens Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/1500