Universität zu Köln

Yesilkaya, Tanju (2005). Kinase-Inhibitoren außerhalb der ATP-Bindungsstelle. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Rezeptortyrosinkinasen (RTK) werden über Autophosphorylierung aktiviert. Damit eine effiziente Autophosphorylierung stattfinden kann, müssen die Kinasedomänen erst dimerisieren, wodurch eine Transformation der Kinase von der inaktiven, offenen zur aktiven, geschlossenen Form induziert wird. Dieser Prozess ist für jede Kinase einzigartig und kann selektiv beeinflusst werden. Anstatt Kinasen über ATP-Analoga zu inhibieren, sollten alternative Konzepte etabliert werden, die zu einer spezifischen Hemmung der Kinaseaktivität durch Störung des Dimerisierungsmechanismus führen sollten. Ein repräsentatives Ziel dafür ist die strukturell konservierte alpha-Helix D der Kinase. Die alphaD-Helix zählt zu der so genannten Scharnier-Region (hinge region) und bestimmt maßgeblich die Konformationsänderung von der inaktiven zur aktiven Form und vice versa. Ein Peptid, welches 15 Aminosäuren der alphaD-Helix des Insulinrezeptors (IR) umfasst, wurde chemisch synthetisiert. Dieses alphaD-Peptid inhibiert die Kinasen des IR und IGFR signifikant in Autophosphorylierungsreaktionen. Auch in Substratphosphorylierungen wird eine effiziente Inhibition über das Peptid beobachtet. Der Inhibitor ist nicht kompetitiv zu ATP oder Substrat. Der IC50-Wert des Peptid-Inhibitors liegt bei 30 µM. Um die Spezifität des Inhibitors zu testen, wurden zwei Kontrollen durchgeführt. Zum einen wurde ein ebenfalls chemisch synthetisiertes Kontrollpeptid, welches eine zufällig angeordnete Sequenz von 14 AS besitzt, in Auto- und Substratphosphorylierungsreaktionen der IR/IGFR Kinasen eingesetzt. Des Weiteren wurde das alphaD-Peptid bei einem Vertreter der Ser/Thr-Kinasefamilie (Akt-Kinase) verwendet. In beiden Fällen konnte keine Inhibition festgestellt werden. Eine bereits voraktivierte, d.h. vollphosphorylierte Kinase des IGFR in Standardsubstratphosphorylierungen mit dem Substrat polyGluTyr, einem Kopolymer aus Glu und Tyr im Verhältnis 4:1, nicht länger inhibiert werden. Erst bei Verwendung der inaktiven, monomeren Kinase des IR als Substrat trat wieder eine Inhibition auf. Da dieses physiologische Substrat vor allem ein Dimerisierungspartner darstellt, schließe ich daraus, dass der Inhibitor mit der Dimerisierung der Kinase interferiert. Eine Kinasemutante mit der Substitution Arg 1092 zu Gln in der Scharnier-Region bewirkte, dass diese Kinase schwere Defekte in der Autophosphorylierung aufwies und erst in hohen Konzentrationen [> 8 µM] aktiv war. Zudem war die Substraterkennung bei der Phosphorylierung der inaktiven Kinase gestört, wogegen andere Substrate wie polyGluTyr oder ein Teilfragment des IRS-1 von der R1092Q-Mutante akzeptiert wurden. Dies bekräftigt die Annahme, dass die Scharnier-Region inklusive der alphaD-Helix für die Interaktion der IR/IGFR-Kinase mit einer weiteren Kinaseuntereinheit von großer Bedeutung ist. Weitere Experimente mit einer anderen Dimerisierungfläche der IR/IGFR-Kinasen, der Juxtamembran(JM)-Domäne, sollten gezielt weitere regulatorische Mechanismen zur Beeinflussung der Kinaseaktivität liefern. Zu diesem Zweck wurde in der hydrophoben Tasche der JM-Domäne das invariante Tyr 985 (IR) bzw. Tyr 957 (IGFR) zu Gln, Lys und Trp substituiert, um möglichst verschiedene Effekte zu erzielen. Bei Zugabe der JM-Konstrukte des IGFR in der Autophosphorylierung der IGFR-Kinase wurde eine starke Inhibition beobachtet. Dagegen zeigten dieselben JM-Konstrukte eine aktivierende Wirkung in der Substratphosphorylierung einer inaktiven Kinase, die ebenfalls von der IGFR-Kinase katalysiert worden war. Dieser Befund demonstrierte, dass die Regulation der Kinaseaktivität durch Interferenz mit dem Dimerisierungsprozess genauso zur Inhibition wie auch zur Aktivierung der Transferaseaktivität führen kann.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language Kinase inhibitors outside the ATP-binding site English
Translated abstract:	Abstract Language Receptor tyrosine kinases (RTKs) are activated by autophosphorylation. A prerequisite for autophosphorylation is dimerization of the kinase domains, which induces the transformation from the open, inactive to the closed, active conformation of the kinase. Targeting the unique dimerization process of a kinase should lead to specific inhibition in contrast to ATP mimics which are commonly applied for this purpose. As a representative target for such an inhibition, I found the conserved alpha-helix D in the kinase structure. The position of the alphaD-helix as part of the hinge region determines the inactive or active state of the kinase. A peptide comprising 15 residues of the alphaD-helix of the insulin receptor was synthesized chemically. The alphaD-peptide inhibits the kinases of IR and IGFR in autophosphorylation reactions. In addition the phosphoryl transfer in substrate phosphorylation reactions is efficiently inhibited in the 10 µM range. The inhibitor did not decrease the affinity of IR/IGFR kinases for either ATP or substrates significantly. Rather, at 30 µM peptide concentration the kcat of substrate phosphorylations catalyzed by the IR kinase was reduced by over 50 %. The specificity of the inhibitor towards the kinases of the IR family has been proven with a randomized peptide and by the use of an unrelated kinase (Akt), a member of the Ser/Thr-kinase family. In both cases no effect has been observed. Once activated kinase is no longer inhibited by the peptide in standard substrate phosphorylations with polyGluTyr, a copolymer of Glu and Tyr in a 4:1 ratio. However, by choosing an inactive kinase mutant (IRKD-D/A) as a substrate, inhibition was restored. IRKD-D/A serves primarily as a dimerization partner. Thus, I conclude that the peptide disrupts the kinase dimerization process. Furthermore, a kinase mutant of the IR with the substitution R1092Q in the hinge region showed impaired activity. Kinase activity was restored when the autophosphorylation was carried out in high concentration [> 8 µM]. However, the active kinase mutant failed to phosphorylate a kinase-dead mutant (IRKD-D/A) efficiently, but showed no defects in standard substrate phosphorylations with polyGluTyr or a fragment of the physiological substrate IRS-1. Thus, I postulate that the hinge region with the alphaD-Helix is necessary for a specific and productive interaction of two kinase subunits. Additional experiments with another dimerization site of the IR/IGFR kinases, the juxtamembrane domain (JM), were performed to achieve a specific regulation of kinase activity. For this purpose the invariant Tyr 985 (IR) and Tyr 957 (IGFR), respectively, in the conserved hydrophobic groove were replaced with Gln, Lys and Trp, to gain distinctive effects. A strong inhibition of the IGFR kinase autophosphorylations was observed when all JM constructs were added into the reaction. In contrast, the same constructs exposed an activating effect in substrate phosphorylations of the inactive kinase-mutant, IRKD-D/A. These results demonstrate that regulation of kinase activity by interfering with the unique dimerization process can lead to both inhibition and activation of the kinase. English
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Yesilkaya, Tanju tanju.yesilkaya@uni-koeln.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-15163
Date:	2005
Language:	German
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Chemistry > Institute of Biochemistry
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Kinase, Inhibitor, ATP-Bindungsstelle, Insulinrezeptor German Kinase, Inhibitor, ATP-binding site, Insulin receptor English
Date of oral exam:	12 July 2005
Referee:	Name Academic Title Klein, Helmut W. Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/1516