Regulation der O-Glykosylierung in GlcNAc/GalNAc-Epimerase-defizienten CHO-Mutanten

Bölinger, Regine (2005). Regulation der O-Glykosylierung in GlcNAc/GalNAc-Epimerase-defizienten CHO-Mutanten. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

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Abstract

Aufgrund der sukzessiven Addition von Monosaccharid-Bausteinen wird vermutet, dass neben der Peptidsequenz auch epigenetische Parameter wie die Kompetition zwischen enzymatischen Schritten bei der Initiation und der Elongation von O-Glykanen einen Einfluss auf den Ort und die Struktur der Glykane ausueben. Durch die rekombinante Glykosylierungssonde MUC1 in ldlD-Zellen, die durch eine defekte UDP-GlcNAc/UDP-GalNAc-Epimerase gekennzeichnet sind, konnte extern die O-Glykosylierung durch Supplementierung mit GalNAc (Initiation der O-Glykosylierung) und Gal und GalNAc (Elongation) beeinflusst werden. Durch Kotransfektion der core2 defizienten Zellen mit der core2 spezifischen GlcNAc-Transferase (C2GnT3) konnten Einfluesse der core2-Synthese auf das O-Glykosylierungsprofil der MUC1-Sonde in ldlD-Zellen untersucht werden. In dem O-Glykosylierungsprofil nicht kotransfizierter ldlD-Zellen dominierten sialylierte core1-Trisaccharide vergleichbar mit dem Glykanprofil der Wildtyp-CHO-Zellen. Durch die Koexpression mit C2GnT3 konnten core2-Strukturen (bei Supplementierung mit Gal und GalNAc) detektiert werden. Wie erwartet konkurrierte die 6-Sialylierung von core1 (Gal-GalNAc) direkt mit der Addition von GlcNAc durch C2GnT3. Auch eine indirekte Kompetition zwischen 3-Sialyltransferase und C2GnT3 konnte nachgewiesen werden. Bei partieller Supplementierung mit GalNAc konnten die kotransfizierten Zellen keine core2-Strukturen bilden. Das Vorhandensein von core1 in Zellen, die nicht mit Gal supplementiert wurden, koennte ein Hinweis auf eine teilweise funktionierende Epimerase sein, wobei auch die Moeglichkeit einer Aufnahme von Gal aus Serumglykoproteinen des FKS nicht aufgeschlossen werden kann. In vitro Studien zeigten, dass Peptidsubstrate mit komplexer O-Glykosylierung (sialyl-T) sowohl eine weitere Initation in benachbarten Positionen erlauben als auch die Synthese von core2-Strukturen. Diese Erkenntnisse koennten Bedeutung fuer die Aufglykosylierung von Membranglykoproteinen haben, die durch das Trans-Golgi-Netzwerk rezyklisieren.

Item Type:

Thesis (PhD thesis)

Translated abstract:

Abstract

Language

O-glycan biosynthesis proceeds by sequential addition of monosaccharides. Hence a competition between the glycosyltransferases involved in initiation and elongation of the glycan chains can be anticipated. To get insight into the regulation of the in vivo O-glycosylation a recombinant MUC1-probe expressed in ldlD-cells, which lack UDP-GlcNAc/UDP-GalNAc epimerase was used. The O-glycan formation in ldlD-cells can be controlled by medium supplementation with GalNAc (initiation of O-glycans) or GalNAc and Gal (elongation of the glycans). In order to elucidate a competition of the core2GnT3 with the core1-specific 3- or 6-sialyltransferases (6GalNAcST) ldlD-cells were cotransfected with the respective glycosyltransferase gene to form core2-glycans. The secretory MUC1 fusion protein was isolated by affinity chromatography and by rpHPLC and analysed for alterations of the O-glycosylation profiles. The glycans were liberated by hydrazinolysis, labelled with 2-aminobenzamide and separated on a polymeric amino-phase column. The profiles of fusion protein from non-cotransfected and cotransfected ldlD-cells differed significantly with respect to qualitative and quantitative aspects. MUC1 probes from cotransfectants in the presence of GalNAc and Gal displayed de novo core2 formation and a decrease of Gal1-3(NeuAc2-6)GalNAc, in accordance with the expected competition between C2GnT3 and 6GalNAcST for the same substrate position. Core2 formation also competed with 3GalST-activity. On partial supplementation, with GalNAc only, the cotransfected cells are unable to form core2 structures. The formation of core1 in UDP-GlcNAc/UDP-GalNAc epimerase defective cells, which were not supplemented with Gal, remains unexplained and may indicate that the epimerase is partially functional. This assumption is supported by observation that ldlD-cells in the absence of supplementing sugars were able to partially O-glycosylate the MUC1 probe. The findings from in vivo studies were completed by in vitro studies with synthetic glycopeptides, which indicated that the sialyl-T-structure has no significant inhibitory effect on vicinal/proximal elongation by core2-transferase T3 or initiation by ppGalNAc-T1/T2. These results from in vitro experiments could explain in vivo studies which showed that membrane-bound MUC1 is recycled several times to reach complete glycosylation.

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