Universität zu Köln

Fröhlich, Marceli Stanislaw (2005). Funktionen molekularer Chaperone in der Qualitätskontrolle zytosolischer Proteine. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Gegenstand der vorliegenden Arbeit war die Identifizierung von Komponenten des zellulären, cytosolischen Protein Qualitätskontrollsystems in der Bäckerhefe S. cerevisiae. Der Begriff Protein Qualitätskontrolle (PQC) bezeichnet zelluläre Prozesse, die die Faltung neusynthetisierter Proteine in ihre native, dreidimensionale Konformation überwachen und entweder die Rückfaltung mutierter Proteine oder deren Abbau vermitteln. Zentrale Komponenten der PQC in eukaryotischen Zellen sind die molekularen Chaperone und das Ubiquitin Proteasom System (UPS). Für die Untersuchung der PQC in vivo, wurden faltungsdefekte DHFR Modellsubstrate generiert, die einem raschen, Proteasom abhängigen Abbau unterlagen. Die Analysen zeigten, dass die mutierten DHFR Varianten im Gegensatz zum Wildtyp-Protein in S. cerevisiae effizient ubiquityliert wurden. Diese Reaktion wird durch die Aktivität der E2 Enzyme Ubc4 und Ubc5 vermittelt. Zusätzlich konnte beobachtet werden, dass die faltungsdefekten DHFR Modellsubstrate zur Bildung von Proteinaggregaten in Zellen tendieren. Um die Funktionen cytosolischer, molekularer Chaperone im Abbau falsch gefalteter Proteine zu untersuchen, wurde die Stabilität der DHFR-Modellsubstrate in verschiedenen S. cerevisiae Stämmen mit eingeschränkter Chaperon Funktion analysiert. Auf diese Weise konnte gezeigt werden, dass für die effiziente Proteolyse der Modellsubstrate die Ssa Familie der Hsp70 Chaperone und die zugehörigen Cofaktoren Ydj1 und Fes1, sowie die Chaperone der Hsp90 Klasse benötigt werden. Hierbei übernehmen die verschiedenen Chaperon-Klassen unterschiedliche Funktionen im Abbau der Modellsubstrate. Ssa1, Ydj1 und Fes1 bilden wahrscheinlich einen funktionellen Komplex, der möglicherweise an der Erkennung und Ubiquitylierung der Substrate beteiligt ist. Sie werden spezifisch für den Abbau faltungsdefekter Proteine, nicht aber für die Beseitigung anderer Substrate des Ubiquitin Proteasom Systems benötigt. Zusätzlich konnte hier eine verstärkte Aggregation der Modellsubstrate beobachtet werden. Im Gegensatz dazu konnte den Hsp90-Chaperonen eine Funktion beim Abbau ubiquitylierter Formen zugeschrieben werden. Möglicherweise werden diese Chaperone benötigt, um die Interaktion polyubiquitylierter Substrate mit dem Proteasom zu ermöglichen. Der Befund, dass auch andere ubiquitylierte Substrate in Abwesenheit funktioneller Hsp90-Chaperone stabilisiert sind, während Ubiquitin-unabhängige Proteasomsubstrate weiterhin abgebaut werden, deutet ebenfalls auf eine solche Funktion hin. Es konnte außerdem gezeigt werden, dass in diesem Fall eine deutliche Akkumulation polyubiquitylierter Substrate in der Zelle vorliegt. Hingegen konnte hier keine verstärkte Aggregation der Modellsubstrate beobachtet werden.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language Roles of molecular chaperones in the quality control of cytosolic proteins English
Translated abstract:	Abstract Language Protein quality control (PQC) is an important cellular process acting in protein folding, in preventing protein aggregation and in degradation of misfolded proteins. The central players in PQC in eukaryotic cells are molecular chaperones and the ubiquitin proteasome system (UPS). In this study, misfolded DHFR model substrates were generated which are subject to rapid 26S proteasome dependent degradation in vivo. By using these model substrates different components where identified that function in cellular PQC in the cytosol of the yeast S. cerevisiae. It could be shown that misfolded variants of DHFR model substrates but not the native protein are efficiently ubiquitylated in vivo. This reaction is mediated by the E2 enzymes Ubc4 and Ubc5. In addition, we observed that misfolded DHFR substrates tend to form protein aggregates in the cell. In order to investigate whether cytosolic molecular chaperones play a role in the degradation of misfolded proteins we analysed the stability of DHFR model substrates in different chaperone mutants. It could be shown that rapid degradation of abnormal DHFR substrates requires the activity of distinct chaperone classes including the Ssa family of Hsp70 chaperones and its cofactors Ydj1 and Fes1, as well as the Hsp90 class of chaperones. Surprisingly, the Hsp70 and Hsp90 chaperones assume quite different functions in the degradation of abnormal proteins. Ssa1, Ydj1 and Fes1 are most likely involved in the recognition and ubiquitylation of substrates by forming a functional complex. The present findings indicate that these chaperones are involved specifically in the degradation of misfolded proteins and not in the elimination of other substrates of the ubiqutin proteasome system. In addition, the absence of those chaperones enhanced aggregation of abnormal DHFR model substrates. The Hsp90 class of chaperones, in contrast, is required for the elimination of already ubiquitylated proteins by the proteasome. This is supported by the finding that abnormal and other ubiquitylated substrates are stabilized in the absence of Hsp90 chaperones, whereas the degradation of ubiquitin independent substrates is not impaired. These chaperones may act as adapter proteins and mediate the interaction of polyubiquitylated substrates with proteasomes. In addition, it could be shown that the total amount of polyubiquitylated proteins is significantly increased in hsp90 mutant cells. In contrast to hsp70, no increased aggregation of abnormal DHFR model substrates could be observed in the absence of Hsp90 chaperones. English
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Fröhlich, Marceli Stanislaw m.froehlich@uni-koeln.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-15319
Date:	2005
Language:	German
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Biology > Institute for Genetics
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language faltungsdefekte Proteine , molekulare Chaperone German misfolded proteins , molecular chaperones English
Date of oral exam:	14 July 2005
Referee:	Name Academic Title Dohmen, Jürgen Prof.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/1531