Universität zu Köln

Zhao, Tie-Han (2005). Development of a Two Component Ac/Ds System for Targeted Gene Tagging in Barley. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

We have generated a large number of transgenic barley plants carrying the maize transposons Activator (Ac) and Dissociation (Ds) by Agrobacterium-mediated transformation. The average efficiency of transformation was more than 20%. Approximately 50% of the transgenic lines contain a single copy of the Ds element. The single-copy Ds lines have been used as launch pads to develop a population for targeted gene tagging in barley. In order to define Ds launch pads for targeted insertional mutagenesis, 16 T-DNA insertion site and 38 secondary insertion sites of transposed Ds elements were genetically mapped by a sequence-based SSCP (single strand conformation polymorphism) analysis approach and RFLP analysis. The mapping results showed that Ds elements preferentially transposed into genetically linked sites. Single-copy Ds containing plants lines were crossed with lines expressing the Actransposase gene to activate the Ds element. F2 plants resulting from these crosses showed an average Ds excision frequency of 52% with a variation between 33% and 75% depending on the Ds starter lines used. A detailed molecular analysis of T-DNA integration sites in barley genome was carried out using single-copy transgenic lines. Sequence analysis of T-DNA flanking regions showed a non-random distribution of T-DNA integration sites in the genome. Approximately 50% of the T-DNA insertions are found to be in gene-coding regions and 26 % of the T-DNA insertions are in repetitive regions of the barley genome. Likewise, the sequence analysis of isolated Ds flanking DNA showed that Ds preferentially inserted into coding region in the barley genome and is underrepresented in repetitive or non-coding regions. Therefore, the combination of Agrobacterium-mediated transformation and the Ac/Ds transposon system takes advantage of the insertion characteristics of the T-DNA and the Ds elements. The T-DNA positions the Ds element preferentially in a gene-rich region from where Ds elements can be activated to transpose into closely linked sites resulting in high gene tagging frequencies. An Ac/Ds-based gene tagging system has been developed which has potential to be an efficient tool for high-throughput insertional mutagenesis in barley. Due to the synteny between the genomes of Triticeae species, the development of such a system promises to provide a useful tool for functional genomics in other Triticeae species as well.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Durch Agrobakterium-vermittelte Transformation wurde eine große Anzahl transgener Gerstenpflanzen mit den Maistransposons Activator (Ac) and Dissociation (Ds) erzeugt. Die durchschnittliche Transformationseffizienz lag dabei bei über 20%. Etwa 50% der transgenen Linien enthalten das Ds element als single-copy Insertion. Die sincle-copy Ds Linien wurden als Startpositionen verwendet, um eine Population zum zielgerichteten Gen-tagging zu entwickeln. Um Ds Startpositionen fürs zielgerichtete Gen-tagging zu definieren, wurden 16 T-DNA Insertionsstellen und 38 Insertionsstellen transponierter Ds Elemente SSCP and RFLP Analyse genetisch kartiert. Die Kartierung von transponierten Ds Elementen zeigte eine bevorzugte Insertion in genetisch eng benachbarten Bereichen. Ds Elemente in single-copy transgenen Pflanzen wurden durch Kreuzen mit AcTransposase exprimierenden Pflanzen zum Springen aktiviert. Die aus den Kreuzungen resultierenden F2 Pflanzen zeigten eine durchschnittliche Excisionsfrequenz von 52%, wobei die Frequenzen je nach Starter Linie zwischen 33% und 75% variierten. Mit den Linien, die nur eine Kopie des Transgens enthalten, wurde eine detailierte molekulare Analyse der T-DNA Insertionsstellen durchgeführt. Die Sequenzanalyse der T-DNA flankierenden genomischen Gersten DNA zeigte, dass die T-DNA Integration in Gerste nicht zufällig erfolgt. Ungefähr 50% der T-DNA Insertionen wurden in codierenden Bereichen und 26% in repetitiven Regionen des Gersten Genoms gefunden. Ebenso zeigte die Sequenzanalyse der Ds flankierenden DNA, daß Ds bevorzugt in codierende Regionen des Gerstengenoms springt und in repetitiven und nicht-codierenden Regionen unterrepräsentiert ist. Folglich verbindet die Kombination der Agrobakterium-vermittelten Transformation und des Ac/Ds Transposonsystems in vorteilhafter Weise die Eigenschaften der T-DNA und der Ds Elemente. Die T-DNA führt zur Integartion der Ds Elemente in Gen-reichen Regionen, von wo sie dann zu Transpositionen in genetisch eng verknüpfte Bereiche aktiviert werden können. Dies resultiert dann in hohen Gen-tagging Frequenzen. Es wurde ein auf den Maistransposons Ac/Ds basierendes Gen-tagging System entwickelt, das potentiell ein effizientes Instrument zur Hochdurchsatz Insertionsmutagenese in Gerste ist. Aufgrund der Syntheny zwischen den Genomen der Triticeen verspricht die Enwicklung eines solchen Systems auch für andere Triticeae ein hilfreiches Instrument zur funktionellen Genomanalyse zu werden. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Zhao, Tie-Han tzhao@mpiz-koeln.mpg.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-15537
Date:	2005
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Außeruniversitäre Forschungseinrichtungen > MPI for Plant Breeding Research
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Barley , Ac/Ds , Gene tagging English
Date of oral exam:	10 July 2005
Referee:	Name Academic Title Schulze-Lefert, Paul Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/1553