Universität zu Köln

Ko, Ya-Ping (2005). Analysis of matrilin function in knockout mice and knockdown zebrafish. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

The matrilins are non-collagenous extracellular matrix proteins that form a subbranch of the superfamily of proteins containing VWA domains. Four matrilins are present in mammals, matrilin-1, -2, -3 and �4. The matrilins contain one or two VWA domains which are connected by a varying number of EGF-like domains, followed by a C-terminal a-helical coiled-coil domain. Matrilins serve as adaptors in the assembly of supramolecular structures in the extracellular matrix, but it is not known if this role is static or dynamic in nature. The in vivo functions of matrilins remain unclear and need to be elucidated in detail, in particular to understand the role of matrilins in inherited disease. Mutations in the gene encoding human matrilin-3 lead to autosomal dominant skeletal disorders, such as multiple epiphyseal dysplasia (MED), which is characterized by short stature and early onset osteoarthritis, and bilateral hereditary microepiphyseal dysplasia, a variant form of MED characterized by pain in the hip and knee joints. In addition, a mutation in the first EGF-like domain of matrilin-3 has been linked to hand osteoarthritis in the Icelandic population. Matrilin-3 null mice and matrilin-1/-3 double deficient mice were characterized. Homozygous matrilin-3 mutant mice appear normal, are fertile, and show no obvious skeletal malformations. Histological and ultrastructural analyses reveal an endochondral bone formation indistinguishable from that of wildtype animals. Northern blot, immunohistochemical, and biochemical analyses showed no compensatory upregulation of any other member of the matrilin family. In matrilin-1/-3 double null mice, biochemical analyses revealed a molecular phenotype in which the amount of matrilin-4 protein is increased and the band patterns of matrilin-3 and -4 are altered. The upregulation of matrilin-4 is likely to represent a compensatory mechanism. Altogether, the findings suggest functional redundancy among matrilins in mammals and demonstrate that the phenotypes of MED-like disorders are not caused by the absence of matrilin-3, but are likely to be due to dominant negative effects of the mutant proteins. The zebrafish is a well established model organism for the study of vertebrate development. The matrilins are present in neither Drosophila nor in C. elegans and the zebrafish is therefore among the simplest organisms which express matrilins. Highly conserved orthologues, matrilin-1, -3a, -3b and �4, are present in zebrafish, while the matrilin-2 gene is missing. The temporal and spatial expression of zebrafish matrilins was characterized. Zebrafish matrilin-1 was found not only in skeletal tissue but also in notochord and intestine. Matrilin-3a expression is restricted to skeletal tissues, while the expression pattern of matrilin-3b has not yet been elucidated due to the lack of a specific antibody. Nevertheless, RT-PCR analysis reveals that matrilin-3b is expressed at 24 hpf and, interestingly, splice variants of matrilin-3b containing a proline- and serine/threonine-rich domain are found only in embryos but not in adult fish, indicating that this new domain probably has an important function during zebrafish development. Similar to in mammals, matrilin-4 is the earliest and most widely expressed matrilin in zebrafish. Matrilin-4 is strongly expressed already at 24 hpf and is present in the skeletal tissues, soft connective tissues and nervous tissues. Morpholino antisense oligonucleotides were used to knockdown matrilins expressed in zebrafish. Malformations were seen at all the doses used and the phenotypes matched to the tissue distribution of the respective matrilin. Injection of matrilin-1 or matrilin-4 morpholinos give curled body shape, smaller eyes or a truncated body axis depending on dosage. The matrilin-3a knockdown embryos showed a serious skeletal phenotype.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language Analyse der Funktion von Matrilinen in Knockoutmaeusen und Knockdownzebrafischen German
Translated abstract:	Abstract Language Die Matriline gehören zu den nicht-kollagenen Proteinen der extrazellulären Matrix, die einen Zweig der von Willebrandfaktor A Domänen (VWA) enthaltenden Proteinfamilie bilden. Bei Säugetieren gibt es insgesamt vier Matriline, Matrilin-1, -2, -3 und �4. Die Matriline enthalten ein oder zwei VWA Domänen, die durch eine unterschiedliche An- zahl von epidermalem Wachstumsfaktor ähnlichen Domänen (EGF) verbunden sind, ge- folgt von einer C-terminalen a-helikalen Coiled-Coil Domäne. Die Matriline dienen als Adaptorproteine bei der Verbindung von supramolekularen Strukturen in der extra- zellulären Matrix, es ist aber noch unbekannt, ob die Matriline dabei eine statische oder dynamische Rolle spielen. Die genauen in vivo Funktionen der Matriline verbleiben un- klar und müssen noch aufgeklärt werden, insbesondere die Rolle, die die Matriline bei der Entstehung von bestimmten Erbkrankheiten spielen. Mutationen im menschlichen Matrilin-3 Gen führen zu autosomal dominanten Erb- krankheiten des Skelettsystems, wie z. B. der multiplen epiphysären Dysplasie (MED), die sich durch eine geringe Körpergröße und eine frühzeitig einsetzende Arthrose aus- zeichnen oder der bilateralen erblichen mikroepiphysären Dysplasie, einer Variante der MED, die durch Schmerzen in Hüft- und Kniegelenken charakterisiert ist. Außerdem wurde in der isländischen Bevölkerung eine Mutation in der ersten EGF Domäne von Matrilin-3 mit dem Vorkommen von Handarthrose in Verbindung gebracht. Matrilin-3 defiziente und Matrilin-1/-3 doppeldefiziente Mäuse wurden untersucht. Die homozygoten, mutierten Matrilin-3 Mäuse sehen normal aus, sind fruchtbar und haben keinen offensichtlichen skeletalen Phänotyp. Histologische und ultrastrukturelle Unter- suchungen zeigten eine endochondrale Knochenentwicklung, die sich von der vom Wildtyp nicht unterschied. Northernblot, Immunhistochemie und biochemische Analy- sen ergaben keine Hinweise auf eine Hochregulation der anderen Matriline, die das Feh- len von Matrilin-3 hätten kompensieren können. Bei der biochemischen Analyse der Matrilin-1/-3 doppeldefizienten Mäuse dagegen wurde ein molekularer Phänotyp ent- deckt, in dem die Menge an Matrilin-4 erhöht war und sich das Bandenmuster von Ma- trilin-3 und �4 verändert hatte. Die Hochregulation von Matrilin-4 beruht wahrschein- lich auf einem Kompensationsmechanismus. Insgesamt deuten die Ergebnisse auf eine funktionelle Redundanz der Matriline bei Säugetieren hin. Die Phänotypen der skeleta- len Erkrankungen sind wahrscheinlich nicht durch das Fehlen von Matrilin-3 in der Ma- trix, sondern eher durch einen dominant negativen Effekt der mutierten Proteine zu er- klären. Der Zebrafish ist ein gut eingeführter Modellorganismus bei der Untersuchung der Entwicklung von Wirbeltieren. Da die Matriline weder in Drosophila noch in C. elegans vorkommen, gehört der Zebrafisch zu den einfachsten Lebewesen, die Matriline exprimieren. Im Zebrafisch gibt es hoch konservierte orthologe Gene, die für Matrilin-1, -3a, 3b und �4 kodieren, während ein Matrilin-2 Gen fehlt. Die zeitliche und räumliche Expression von Matrilinen im Zebrafisch wurde untersucht. Zebrafisch Matrilin-1 konnte nicht nur in skeletalen Geweben, sondern auch im Notochord und Dünndarm nachgewiesen werden. Die Matrilin-3a Expression beschränkt sich auf skeletale Gewebe, während die Matrilin-3b Expression nicht untersucht werden konnte, da ein geeigneter Antikörper nicht zur Verfügung stand. Dennoch konnte mit Hilfe von RT-PCR bereits nachgewiesen werden, dass Matrilin-3b bereits 24 Stunden nach der Befruchtung exprimiert wird. Interessanterweise gibt es Spleißvarianten von Matrilin-3b, die eine an Prolin und Serin/Threonin reiche Domäne enthalten, welche nur in Embryos, aber nicht in erwachsenen Tieren vorkommt, was darauf hinweist, dass die Domäne möglicherweise eine Rolle während der Zebrafischentwicklung spielt. Wie bei Säugetieren ist Matrilin-4 beim Zebrafisch das am frühesten und breitesten exprimierte Matrilin. Matrilin-4 ist bereits 24 Stunden nach der Befruchtung stark exprimiert und kommt in skeletalen Geweben, weichen Bindegeweben und in Nervengeweben vor. Morpholino Gegenstrangoligonukleotide wurden eingesetzt, um die Expression der Ma- triline im Zebrafisch zeitweilig zu unterbinden. Fehlbildungen wurden bei allen ange- wandten Dosierungen bobachtet und die Phänotypen passen zu der Gewebeverteilung der entsprechenden Matriline. Abhängig von der Dosis ergaben die Injektionen von Ma- trilin-1 bzw. Matrilin-4 spezifischen Morpholinos Tiere mit verdrehtem Körper, klei- neren Augen oder gar einer verkürzten Körperachse. Die mit einem Matrilin-3a spe- zifischen Morpholino behandelten Tiere zeigten einen schweren skeletalen Phänotyp. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Ko, Ya-Ping yaping.ko@uni-koeln.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-15725
Date:	2005
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Medicine > Biochemie > Institut II für Biochemie
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Matrilin , Zebrafisch , Knockout , Knockdown , extrazellulaere Matrix German matrilin , zebrafish , knockout , knockdown , extracellular matrix English
Date of oral exam:	10 July 2005
Referee:	Name Academic Title Paulsson, Mats Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/1572