Characterization of regulatory roles of DPBF4 and SNF4 in sugar and stress signaling in Arabidopsis

Shukla, Vijaya (2005). Characterization of regulatory roles of DPBF4 and SNF4 in sugar and stress signaling in Arabidopsis. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

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Abstract

In higher plants, the regulation of metabolic and developmetal processes is tightly connected to a complex crosstalk between hormone signaling pathways. Many responses controlled by osmotic stress (salinity, drought and cold) stimuli are synergictically induced by the stress hormone abscisic acid and by glucose and sucrose. The ancient pathway of glucose repression, which is found in all organisms, also plays a central role in the regulation of transcription and growth responses in plants, though this pathway negatively controls the activity of genes involved in photosynthesis. Glucose and sucrose essentially signal through stimulation of ABA synthesis, whereas ABA signaling requires elements of the ethylene signaling pathway. Within this web of signaling functions, the closely related SnRK1 and SnRK2 families of protein kinases play a distinguished role. Whereas SnRK1 enzymes are key cellular glucose and AMP sensors, which monitor the cells� energy homeostasis, their relatives in the SnRK2 kinase family participate in the regulation cellular responses to osmotic stress stimuli by estabilishing connections between early signaling events, such as generation of secondary messengers, and direct regulation of the activity of transcription factors by phosphorylation. In this work a study of the function and regulation of an Arabidopsis bZIP transcription factor, DPBF4, is described. DPBF4 was identified as a G-box binding factor, which recognizes glucose -responsive regulatory sequences in the promoter of the aspartate kinase gene AK1/HSD1 implicated in the control of biosynthesis of essential amino acids. DPBF4 is a member of the ABI5/DPBF/AREB/ABF bZIP family, which include closely related transcription factors. Analysis of dpbf4 knockout mutations suggests fuctional redundancy of Arabidopsis DPBF homologs. DPBF4 is a substrate of the SnRK2 protein kinase OST1 (OPEN STOMATA). Characterization of OST1 shows that this kinase is capable of autophosphorylation within its activating T-loop and recognizes common substrates with members of the SnRK1 kinase family. Mapping of critical amino acid residues by site-specific mutagenesis provides an insight into details of regulation of SnRK2 kinase activity. OST1 is probably required for stimulation of dimerization and DNA-binding of DPBF4, which was found in chromatin-associated protein complexes. Chromatin crosslinking experiments show that DPBF4 indeed occupies specific cis-regulatory elements in the promoter of the model AK1/HSD1 aspartokinase gene. DPBF4 turned out to be also a substrate of SnRK1 kinases, whose activation is controled by their SNF4 gamma subunits. Characterization of knockout mutations demonstrates that SNF4 is essential for male gametogenesis. SNF4 is a nuclear kinase subunit and its nuclear import appears to be light-regulated. The work described in this thesis offers a wide repertoire of molecular, genetic and biochemical tools for dissection of regulatory elements of glucose and stress signaling pathway, in particular for identification of partners and regulators of DPBF-like bZIP proteins and protein kinases of SnRK1 and SnRK2 families.

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Thesis (PhD thesis)

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Charakterisierung der Rolle von DPBF4 und SNF4 in Zucker- und Stresssignalwegen in Arabidopsis	German

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Abstract

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In höheren Pflanzen ist die Regulation von Entwicklungsprozessen und des Metabolismus fest zu einer komplexen Interaktion zwischen Hormonsignaltransduktionswegen verbunden. Viele Reaktionen die durch osmotischen Stress (Salzgehalt, Dürre und Kälte) kontrolliert werden, sind synergistisch durch das Stresshormon Abszisinsäure (ABA), durch Glucose und Saccharose induziert. Der historische Stoffwechselweg der Glucose-Hemmung, der in allen Organismen vertreten ist, spielt auch eine zentrale Rolle in der Regulation der Transkription und der Wachstumsantwort in Pflanzen, obwohl dieser Stoffwechselweg die Aktivität von Genen, die an der Photosynthese beteiligt sind negativ reguliert. Grundsätzlich wirken Glucose und Saccharose durch die Stimulation der ABA-Synthese. Die ABA-Signaltransduktion ihrerseits benötigt Elemente der Ethylene-Signaltransduktion. Innerhalb dieses Netzwerks aus Signalfunktionen, spielen die eng verwandten Proteinkinasefamilien SnRK1 und SnRK2 unterschiedliche Rollen. Während SnRK1 Enzyme eine zentrale Rolle als zelluläre Glucose und AMP Sensoren spielen, die die zelluläre Energie-Homeostase monitoren, sind ihre verwandten SnRK2 Kinasen an der Regulation zellulärer Reaktionen auf osmotische Stress-Stimuli beteiligt. Dabei bilden sie eine Verbindung zwischen frühen Signaltransduktionsereignissen wie die Generation so genannter �secondary messengers� und der direkten Regulation der Aktivität von Transkriptionsfaktoren durch Phosphorylierung aus. In dieser Arbeit wird die Funktion und die Regulation eines bZIP-Transkriptionsfaktors, DPBF4, aus A.thaliana beschrieben. DPBF4 wurde als Bindungsfaktor für G-box-ähnliche, regulatorische Sequenzen im Promotor des durch Saccharose induzierten Aspartat-Kinase-Gens AK1/HSD1, welches an der Regulation der Biosynthese essentieller Aminosäuren beteiligt ist, identifiziert. DPBF4 gehört zur ABI5/DPBF/AREB/ABF bZIP Familie, die nahverwandte Transkriptionsfaktoren einschließt. Die Analyse von dpbf4 Nullmutationen zeigt Redundanz zwischen den DPBF-Homologen aus A.thaliana auf. DPBF4 ist ein Substrat der SnRK2 Proteinkinase OST1 (OPEN STOMATA). Die Charakterisierung von OST1 zeigt das sich diese Kinase innerhalb ihres aktivierenden �T-loop� autophosphoryliert und gemeinsame Substrate mit anderen SnRK1-Kinasen erkennt. Eine Analyse kritischer Aminosäurereste mittels �site-specific mutagenesis�, Punkt-mutantionen, liefert eine detaillierte Einsicht in die Regulation der SnRK2-Kinaseaktivität. OST1 ist wahrscheinlich für die Stimulation der Dimerisierung und DNA-Bindung von DPBF4, welches Bestandteil verschiedener Chromatin-assoziierter Proteinkomplexe ist, benötigt. Chromatin �crosslinking� Experimente zeigen das DPBF4 tatsächlich spezifische cis-regulatorische Elemente im Promotor der Modelaspartokinase AK1/HSD1 besetzt. Es stellte sich heraus, dass DPBF4 auch Substrat der SnRK1-Kinasen, deren Aktivität durch ihre SNF4 gama-Untereinheit reguliert wird, ist. Die Charakterisierung von Nullmutanten demonstriert, daß snf4 Mutationen nicht durch männliche Gameten übertragen werden, was auf ihre essentielle Funktion hindeutet. SNF4 ist eine Kernkinaseuntereinheit, deren Kernimport als Licht reguliert erscheint. Wir zeigen das SNF4 Proteasom assoziiert ist. Die hier beschriebene Arbeit zeigt ein weites Repertoire an molekularen, genetischen und biochemischen Methoden zur Unterscheidung SUMMARY-ZUSAMMENFASSUNG VIII von regulatorischen Elementen der Glucose und der Stress-Signaltransduktion, besonders zur Identifikation von Partnern und Regulatoren der DPBF ähnlichen bZIP-Proteine und Proteinkinasen der SnRK1 und SnRK2 Familien, auf.

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