Zur DNA Sequenz eines klinischen Isolaten ähnlichen HCMV (Humanes Cytomegalievirus) Stammes (Toledo): Veränderte Leserahmen durch zusätzliche Startkodons?

Brondke, Holger (2005). Zur DNA Sequenz eines klinischen Isolaten ähnlichen HCMV (Humanes Cytomegalievirus) Stammes (Toledo): Veränderte Leserahmen durch zusätzliche Startkodons? PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

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Abstract

Die DNA Sequenzen klinischer Isolate des Humanen Cytomegalievirus (HCMV) und des klassischen Laborstammes AD169 können stark voneinander abweichen. Da es für HCMV nur begrenzte Therapiemöglichkeiten gibt und eine Immunisierung bis heute nicht möglich war, sollten über Sequenzvergleiche zwischen HCMV AD169 und HCMV Toledo Gene identifiziert werden, die Ansatzpunkte für eine Therapie der Virusinfektion bieten. In der vorliegenden Arbeit haben wir einen Großteil der DNA Sequenz des klinischen HCMV Isolates Toledo bestimmt, die Aminosäuresequenzen von 127 Offenen Leserahmen (ORFs) ermittelt und mit den Sequenzen des Laborstammes HCMV AD169 verglichen. Ausgehend von aufgereinigter, aus Virionen isolierter DNA des HCMV Stammes Toledo, wurde die DNA Sequenz des klinischen Isolaten ähnlichen Stammes über eine "genome walking" Methode erschlossen. Für die Sequenzierung wurden AD169 Sequenz homologe Primer verwendet. Ein Vergleich der DNA Sequenzen von HCMV AD169 und HCMV Toledo zeigte Basenpaaraustausche, sowie Deletionen und Insertionen. Mehrere ORFs wiesen NH2-terminale Extensionen der kodierenden Regionen auf, die bis zu 123 Aminosäuren lang sein konnten. Einige dieser Extensionen waren hochgradig homolog zwischen den beiden untersuchten HCMV Stämmen. Sechs dieser Extensionen begannen mit AUG, 24 mit CUG und 21 mit GUG, die alle als Translationsstartpunkte in Pro- und Eukaryoten bereits nachgewiesen worden sind. Einige der gefundenen verlängerten Sequenzen könnten veränderte Funktionalitäten in den betroffenen Proteinen bewirken und waren ebenfalls nachweisbar in drei anderen klinischen Isolaten und dem Laborstamm Towne. Es konnte gezeigt werden, daß einige der alternativen Sartkodons in einem Sequenzumfeld lagen, das ihre Benutzung begünstigt, da das postulierte Kozak-Motiv vorkam. Zudem konnte nachgewiesen werden, daß einige der alternativen Startkodons auf den mRNAs vorhanden waren, die in von HCMV infizierten HFF Zellen produziert wurden. Der Beweis der Proteinsynthese über die alternativen Starkodons konnte bis jetzt nicht definitiv erbracht werden, da durchgeführte Expressionsstudien aufgrund technischer Schwierigkeiten bisher noch keine eindeutigen Daten erbracht haben.

Item Type:

Thesis (PhD thesis)

Translated title:

Title	Language
The DNA sequence of a clinical isolate similar strain (Toledo) of HCMV (Human Cytomegalovirus): Altered open reading frames due to additional start codons?	English

Translated abstract:

Abstract

Language

The nucleotide sequences of the DNAs from clinical isolates of human cytomegalovirus (HCMV) and from the standard laboratory strain AD169 can differ considerably. Since in case of an infection with HCMV only limited medical countermeasures are available, we were interested in identifying potential immunomodulating genes in the genome of HCMV which could be targets for further therapeutic studies. We have determined the nucleotide sequences, derived the amino acid sequences of 127 open reading frames (ORFs) in the low-passage Toledo strain of HCMV and compared them to the AD169 sequences. Purified virion-isolated DNA from the Toledo strain has been used in a genomic walking approach with AD169 DNA sequence-derived PCR primers. A comparison of the DNA of the HCMV strains AD169 and Toledo revealed multiple nucleotide mismatches as well as deletions and insertions. There are several potential amino-terminal extensions of coding regions which range in lengths from a few to 123 amino acids. Some of these extended amino acid sequences are very similar, and can occur in either HCMV strain relative to the other. Six extensions start with an AUG, 24 with a CUG, and 21 with a GUG which can serve as translational start codons in pro- and eukaryotes. Some of the extended sequences might bestow altered, biologically functional properties upon the affected proteins, and they are conserved in three clinical isolates and the Towne strain. In support of these notions the analysis of the DNA surrounding the alternative start codons showed that most of these codons displayed a weak homology to the Kozak consensus sequence. These weak homologies could promote the use of the alternative start codons to a certain degree. In addition I could show that some of the postulated alternative start codons were present in mRNAs, which were produced in and isolated from HCMV Toledo infected HFF cells. Due to technical difficulties, searches for extended proteins have not yielded conclusive results.

English

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