Isolation and characterization of potato homologues of Arabidopsis thaliana genes operating in defense signal transduction

Pajerowska-Mukhtar, Karolina (2005). Isolation and characterization of potato homologues of Arabidopsis thaliana genes operating in defense signal transduction. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

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An increasing number of pathogen-defense related genes are being identified and characterized in Arabidopsis thaliana. So far, it is not known whether and which structural and functional homologues of these Arabidopsis genes have any role in natural variation of resistance to pathogens in crops. Using sequence database mining and PCR-based approaches, potato (Solanum tuberosum L.) gene fragments with high sequence similarity to 16 Arabidopsis defense signal transduction genes were obtained, sequenced and genetically positioned on potato molecular maps. Of 16 novel loci, five were positional candidates for known potato pathogen resistance QTL. One of the candidate loci, StAOS2 co-localizing with QTL for resistance to P. infestans and E. carotovora on linkage group XI, was further characterized in more detail. StAOS2 encodes a gene for allene oxide synthase, a cytochrome P450-enzyme, acting upstream in the jasmonic acid biosynthesis pathway. A metabolic block at the level of AOS completely abolishes JA production, which affects plant development (e.g. sterile pollen production) and various abiotic and biotic stress responses (e.g. P. infestans resistance in tomato, E. carotovora resistance in Arabidopsis). The chloroplastic localization of StAOS2-GFP was confirmed by confocal microscopy and functionality of the potato protein was proven by complementation of the male-sterile Arabidopsis aos mutant. StAOS2-RNAi transgenic lines in potato were generated in order to test role of StAOS2 in P. infestans resistance. The measurements of endogenous OPDA and JA in the silenced lines after wounding treatment revealed drastic decrease in the levels of above mentioned compounds (up to 25 folds less than in wild type plants). In addition, natural variation of StAOS2 locus was characterized. Sequencing of the locus across 38 potato chromosomes revealed high polymorphism. Thirteen distinct alleles were found, and four of them showed highly significant (P=0.000, R2=14%) linkage to P. infestans and E. carotovora QTL. Five alleles of StAOS2 were cloned. Sequence analyses revealed a substantial polymorphism on amino acid level, including non-conservative substitutions and an insertion/deletion within the cytochrome P450 domain. Currently, an ongoing quantitative complementation of the Ataos mutant with the five different StAOS2 alleles fused to the native AtAOS promoter, followed by OPDA and JA levels measurements in the transgenic lines, will possibly provide direct evidence for StAOS2 being the first plant resistance QTL identified.

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Thesis (PhD thesis)

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Abstract

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Eine zunehmende Zahl von Genen der Pathogenabwehr wird in Arabidopsis thaliana identifiziert und charakterisiert. Bisher ist nicht bekannt, ob und wenn ja welche strukturellen und funktionellen Homologen dieser Arabidopsis Gene bei der natürlichen Variation von Pathogenresistenz in Nutzpflanzen eine Rolle spielen. Information aus DNA-Sequenz Datenbanken und PCR Methoden wurden genutzt, um Fragmente von Genen der Kartoffel (Solanum tuberosum) zu identifizieren, die eine hohe Sequenzähnlichkeit zu 16 Arabidopsis Genen mit einer Funktion in der Abwehr-Signaltransduktion haben. Diese Kartoffel Genfragmente wurden sequenziert und auf der molekularen Genkarte der Kartoffel positioniert. Fünf der 16 neuen Loci waren positionelle Kandidaten für bekannte Kartoffel QTL (quantitative trait loci) für Pathogenresistenz. Einer der positionellen Kandidatenloci, StAOS2, hatte eine ähnliche Position wie QTL für Resistenz gegen P. infestans und E. carotovora auf der Kopplungsgruppe XI. StAOS2 wurde weiter im Detail strukturell und funktionell charakterisiert. StAOS2 kodiert ein Gen für Allene Oxid Synthase (AOS), ein Cytochrom P450 Enzym, das am Anfang des Biosyntheseweges für Jasmonsäure (jasmonic acid = JA) steht. Eine Blockierung von AOS verhindert die Produktion von JA, wodurch die Pflanzenentwicklung (z. B. die Produktion von fertilem Pollen) und verschiedene abiotische und biotische Stress Antworten beeinflusst werden, in Tomate z. B. die Resistenz gegen P. infestans oder in Arabidopsis die Resistenz gegen E. carotovora. Die Lokalisation von StAOS2-GFP in Chloroplasten wurde mittels confokaler Mikroskopie bestätigt. Die Funktionalität des Kartoffelproteins wurde durch Komplementation der männlich-sterilen Arabidopsis aos Mutante gezeigt. StAOS2-RNAi transgene Kartoffellinien wurden hergestellt, um die Rolle von StAOS2 bei der Resistenz gegen P. infestans zu prüfen. Die Bestimmung von endogenem OPDA und JA nach Verwundung von Blättern in Linien mit sehr geringen Mengen von StAOS2 Transkript ergab eine drastische Verringerung beider Verbindungen (bis zu 25-mal weniger als in Wildtyp-Pflanzen). Die natürliche Variabilität des StAOS2 Locus wurde zusätzlich charakterisiert. Die Sequenzierung von 38 Kartoffelchromosomen an diesem Locus ergab ein hohes Maß an Polymorphismus. Dreizehn verschiedene Allele wurden identifiziert, von denen vier hoch signifikant (P = 0.000, R2 = 14%) mit QTL für Resistenz gegen P. infestans und E. carotovora gekoppelt waren. Fünf StAOS2 Allele wurden kloniert. Die Sequenzanalyse ergab Polymorphismen auf Aminosäure Ebene, einschließlich nicht-konservativer Austausche und einer Insertion/Deletion innerhalb der Cytochrom P450 Domäne. Derzeit wird die quantitative Komplementation der Ataos Mutante mit den fünf verschiedenen StAOS2 Allelen unter der Kontrollen des nativen AtAOS Promotors durchgeführt, gefolgt von einer Bestimmung der OPDA und JA Mengen in den transgenen Linien. Dies kann den direkten Nachweis erbringen, dass StAOS2 das erste in Pflanzen identifizierte Resistenz QTL ist.

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