Universität zu Köln

Bouabe, Hicham (2002). Charakterisierung der asymmetrischen Funktionalität der Nukleotidbindedomänen des ABC-Transporters TAP. Masters thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Der Transporter associated with antigen processing (TAP) gehört zur Familie der ATP-Binding Cassette (ABC)-Transporter (Higgins 1992). TAP besteht aus zwei Untereinheiten TAP1 und TAP2. Jede Untereinheit besteht aus einer Transmembrandomäne (TMD) und einer Nukleotidbindedomäne (NBD). Sowohl die TMDs als auch die NBDs sind funktional verschieden (Alberts et al. 2001, Daumke et al. 2001, Lapinski et al. 2001). Bei den NBDs beruht die unterschiedliche Funktionalität auf intrinsischen Eigenschaften (Daumke et al. 2001). In dieser Arbeit wurde untersucht, in wieweit die ca. 70 Aminosäuren langen C-termini (V-Regionen) und die Kern-NBDs von TAP (siehe Abbildung I.6.) die asymmetrische Funktionalität der Nukleotidbindedomänen bedingen. Dazu wurden rekombinante Transporter hergestellt, in denen die C-Termini oder die Kern-NBDs zwischen NBD1 und NBD2 wechselseitig ausgetauscht wurden (siehe Abbildung I.6.). Überdies wurde eine weitere TAP2-Mutante, der die C-terminale V-Region fehlt, hergestellt. Die cDNAs für diese chimären Transporter wurden in TAP-negativen T2-Zellen stabil transfiziert. Es wurden insgesamt sechzehn T2-Zelllinien, die stabil ein oder zwei TAP-Ketten exprimieren, etabliert. Bei den Untersuchungen zum Nukleotidbindeverhalten stellte sich heraus, daß der C-Terminus von TAP2 eine für ATP-Bindung ungünstige Konformation in der NBD hervorruft, während der C-Terminus von TAP1 die Bindung von ADP und ATP zulässt. Der C-Terminus von TAP2 (V2) stellt möglicherweise einen limitierenden strukturellen Faktor dar, der die Nukleotidbindung während des Transportzyklus reguliert. Die Bindung von ATP in NBD2 blockiert simultane ATP-Bindung in NBD1, was auf eine strukturelle Wechselwirkung zwischen den beiden NBDs hindeutet. Überdies konnte gezeigt werden, daß die ADP-Bindung eine gegebene intrinsische Eigenschaft der Kern-NBD2 ist. Ein verändertes Verhalten bedingt durch die C-Termini wurde auch bei den Peptidbindeeigenschaften der chimären Transporter festgestellt. Die Untersuchungen zum Peptidbindeverhalten zeigten, dass, unabhängig von der Art der Nukleotidbindung der an die TMDs fusionierten NBDs, ein Einfluss auf die Peptidbindung von den NBDs ausgeht. Die Untersuchungen zur Transportaktivität zeigten, daß nur der Transporter 2/1C2 eine nennenswerte Aktivität aufweist. Dies deutet darauf hin, daß die Kern-NBD2 (C2) die Kern NBD1 (C1) ersetzen kann aber umgekehrt nicht. Das spricht dafür, daß der C-Terminus mit der Kern-NBD in Wechselwirkung tritt, diese Wechselwirkung ist in der hergestellten NBD: C1V2 zerstört. Zur Charakterisierung der entscheidenden Aminosäuren, die für den beobachteten Einfluß des C-Terminus verantwortlichen sein könnten, wurden TAP-cDNAs, in denen die Switch-Regionen zwischen NBD1 und NBD2 ausgetauscht wurden, hergestellt. Diese wurden in TAP-negativen T2-Zellen transfiziert und sollen in weiterführenden Studien charakterisiert werden.

Item Type:	Thesis (Masters thesis)
Translated title:	Title Language Characterization of the asymmetrical functionality of the nucleotide binding domains of the ABC-transporter TAP English
Translated abstract:	Abstract Language The transporter associated with antigen processing (TAP) is a member of the ATP-binding-cassette (ABC) family of transporters (Higgins 1992). TAP comprises two polypeptides, TAP1 and TAP2, each with an N-terminal transmembrane domain (TMD) and a C-terminal cytosolic nucleotide binding domain (NBD). Both the TMDs and the NBDs have a functionally different role in the transport cycle (Alberts et al 2001, Daumke et al 2001, Lapinski et al 2001). In the case of the NBDs the different functionality is based on intrinsic properties (Daumke et al. 2001). In this study we investigated the contribution of the approximately 70 amino acid long C-termini (V-regions) and the core NBDs (for nomenclature see figure I.6.) to the asymmetric functionality of the nucleotide binding domains of TAP. To address this, we generated recombinant transporters in which either the nonhomologous C-terminal tails or the core NBDs were reciprocally exchanged (see figure I.6.). Furthermore, a TAP2-mutant lacking the C-terminal V-region was generated as well. The cDNAs for these chimeric transporters were stably transfected into TAP-negative human T2 cells. Sixteen T2 cell lines were established that stably express either single or two TAP chains. The analysis of the nucleotide binding behaviour revealed that the C-terminal tail of TAP2 induces a conformation that is nonpermissive for ATP binding, whereas the C-terminal tail of TAP1 allows the binding of ADP as well as ATP. The C-terminal tail of TAP2 (V2) possibly represents a limiting structural factor which regulates nucleotide binding during the transport cycle. ATP binding to NBD2 prevents simultaneous uptake of ATP by TAP1. This indicates the conformational cross-talk between NBD1 and NBD2. Further results have shown that ADP binding is an intrinsic property of the core NBD2. Further altered behaviour contributed by the C-terminal tails was shown for the peptide binding properties of the chimeric transporters. The peptide binding assays showed that the NBDs have an influence on the peptide binding behaviour independent of the nature of nucleotide bound to the NBDs. The analysis of the transport activity showed that only the transporter 2/1C2 shows a significant transport activity. Thus the core NBD2 (C2) can replace the function of the core NBD1 (C1), but nonreciprocal. This indicates the conformational cross-talk between the C-terminal tail and the core-NBD. This conformational cross-talk is destroyed in the generated NBD: C1V2. To identify the key amino acids responsible for the observed influence of the C-terminal tails, we generated TAP-cDNAs in which The switch regions were reciprocally exchanged between NBD1 and NBD2. These were stably transfected into TAP-negative human T2 cells and should be characterized in further studies. English
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Bouabe, Hicham 0221-2789555 UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-16343
Date:	2002
Language:	German
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Biology > Institute for Genetics
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Antigenpräsentation; Transporter associated with antigen processing; ABC-transporter; Peptidtransport; Nukleotidbindedomäne. German antigen presentation; transporter associated with antigen processing; ABC-transporter; peptide transport; nucleotide binding domains. English
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/1634