Molecular Genetic and Functional Characterization of candidate loci for controlling quantitative resistance to the oomycete Phytophthora infestans

Ilarionova, Evgeniya Valentinova (2006). Molecular Genetic and Functional Characterization of candidate loci for controlling quantitative resistance to the oomycete Phytophthora infestans. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

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Abstract

Late blight is the most devastating potato disease worldwide caused by the oomycete Phytophthora infestans. Lots of breeding efforts are devoted to improve the field resistance to late blight of potato cultivars. Appearance of new pathotypes of P. infestans and the quantitative phenotype of field resistance make the conventional breeding process difficult. The genetics of inheritance of quantitative resistance is not yet fully understood. Marker assisted selection could help to solve the problem to reliably discriminate resistant from susceptible cultivars. The first part of the thesis was focused on identifying genomic regions responsible for resistance to late blight in two new, independent, tetraploid F1 families �SaKa-Ragis� and �BNA�. DNA markers known from previous studies to be linked to resistance loci in the potato genome were tested in the two families, which had been field evaluated in years 2001 and 2002 for late blight resistance and showed normal distribution of the resistance phenotype, indicating polygenic inheritance in both populations. A �cases� and �controls� study was performed. The �cases� were 23 highly resistant and the �controls� were 23 highly susceptible individuals selected from each F1 family. Both populations were genotyped using SNP, CAPS, SSCP and SCAR markers. Markers significantly linked to QTL (quantitative trait locus) for resistance to P. infestans were found on chromosomes II, IV and V in the �BNA� population and on chromosome X in the �SaKa-Ragis� population. The QTL on chromosome X was further characterized by increasing the marker coverage and SNP haplotype construction for CP105, the most significant marker locus. The second part of the thesis was focused on the most significant and reproducible known QTL for resistance to P. infestans on potato chromosome V. This QTL is part of a hot spot for resistance to pathogens in the potato genome (Gebhardt and Valkonen 2001). A major QTL for plant maturity maps to the same genomic region. A genomic region of about 400 kbp including the R1 gene for resistance to P. infestans has been sequenced to identify positional candidate genes besides the R1 gene family (Ballvora et al. 2002). Two contigs have been assembled, one for the �resistant� homologous chromosome with an introgression from the wild potato species Solanum demissum and the other from the �susceptible� allele (Ballvora et al., in preparation). The two contigs were subjected to Gene Mark- gene prediction software resulting in the annotation of 49 ORFs (open reading frames). Based on putative function assignment, 24 of 49 ORFs were selected for further characterization. The expression of the 24 selected ORFs was analyzed by RT-PCR in cDNAs from leaves uninfected and infected with P. infestans, of two diploid potato genotypes, which were the parents of a population showing a major QTL effect on chromosome V but lacked the R1-gene. For 8 ORFs expression was undetectable in leaves. Four genes were up-regulated upon P. infestans infection. The remaining 12 genes were equally expressed in both infected and uninfected leaves, in different intensities. Furthermore, a genetic approach was pursued for the same QTL on chromosome V in order to narrow down genetically the genomic region in which the gene/genes for resistance to P. infestans and maturity are localized. For this objective, 32 highly resistant and late maturing tetraploid cultivars and 33 highly susceptible and early maturing cultivars were selected. The amplicons at six loci on potato chromosome V were sequenced in the 65 cultivars and analyzed for SNPs. At least one SNP in all six loci were significantly associated with maturity and resistance to P. infestans, suggesting extended linkage disequilibrium in a genetic region of about 8 cM on potato chromosome V.

Item Type:

Thesis (PhD thesis)

Translated abstract:

Abstract

Language

Die Kraut- und Knollenfäule ist die weltweit zerstörerischste Krankheit der Kartoffel und wird durch den Oomyzeten Phytophthora infestans verursacht. Viele Bemühungen in der Züchtung sind darauf gerichtet, die Feldresistenz von Kartoffelsorten gegen die Krautfäule zu verbessern. Das Auftreten neuer P. infestans Pathotypen und der quantitative Phänotyp der Resistenz erschweren den konventionellen Züchtungsprozess. Marker-gestützte Züchtung könnte helfen, das Problem der verlässlichen Unterscheidung von resistenten und anfälligen Pflanzen zu lösen. Der erste Teil der Doktorarbeit konzentrierte sich auf die Identifizierung von genomischen Regionen für Resistenz gegen die Krautfäule in zwei neuen, voneinander unabhängigen, tetraploiden F1 Familien �SaKa-Ragis� und �BNA�. In den beiden Familien wurden DNA Marker getestet, die, wie aus vorhergehenden Studien bekannt, mit Resistenzloci im Kartoffelgenom gekoppelt sind. Beide Familien waren in den Jahren 2001 und 2002 im Feld auf Krautfäuleresistenz geprüft worden. Der Resistenzphänotyp war in beiden Populationen normal verteilt und zeigte damit polygene Vererbung. Es wurde eine �case/control� Studie durchgeführt. �Cases� bzw. �controls� waren 23 hoch resistente bzw. 23 hoch anfällige Individuen, die aus jeder F1 Familie selektiert worden waren. Beide Populationen wurden mit SNP, CAPS, SSCP und SCAR Markern genotypisiert. Mit QTL (quantitative trait locus) für Resistenz gegen P. infestans signifikant gekoppelte Marker wurden in der �BNA� Population auf den Chromosomen II, IV und V gefunden, und in der �SaKa-Ragis� Population auf Chromosom X. Das QTL auf Chromosom X wurde weiter charakterisiert durch Analyse weiterer Marker und durch Konstruktion von SNP Haplotypen für CP105, den signifikantesten Marker Locus. Der zweite Teil der Doktorarbeit konzentrierte sich auf das signifikanteste und reproduzierbarste bekannte QTL für Resistenz gegen P. infestans auf Kartoffelchromosom V. Dieses QTL ist Teil eines �hot spots� für Pathogenresistenz im Genom der Kartoffel (Gebhardt and Valkonen 2001). Ein Haupt-QTL für die Reifezeit der Pflanzen kartiert in die gleiche genomische Region. Eine Genomabschnitt von 400 kbp einschließlich des R1 Gens für Resistenz gegen P. infestans (Ballvora et al. 2002) ist sequenziert worden, um positionelle Kandidatengene neben der R1 Genfamilie zu identifizieren. Zwei �contigs� wurden konstruiert, eines für das �resistente� homologe Chromosom mit einer Introgression aus der Wildkartoffelart Solanum demissum und das andere für das �anfällige� Allel (Ballvora et al., in preparation). Die Untersuchung beider Contigs mit dem �Gene Mark� Gen-Annotationsprogram ergab 49 ORFs (open reading frames). Basierend auf der möglichen Funktions-Annotation wurden 24 der 49 ORFs für eine weitere Charakterisierung ausgewählt. Die Expression der 24 ausgewählten ORFs wurde mittels RT-PCR in cDNAs von nicht-infizierten und von P. infestans infizierten Blättern analysiert, und zwar in zwei diploiden Genotypen, den Eltern einer Nachkommenschaft, die einen Haupt-QTL Effekt auf Chromosom V gezeigt hatte, die aber nicht das R1 Gen enthielt. Die Expression von 8 ORFs war in Blättern nicht nachweisbar. Vier Gene zeigten eine erhöhte Expression in P. infestans infizierten Blättern. Die übrigen 12 Gene waren in infizierten und nicht infizierten Blättern gleich exprimiert, mit unterschiedlicher Intensität. Zusätzlich wurde für das gleiche QTL auf Chromosom V ein genetischer Ansatz verfolgt, um die Genomregion einzugrenzen, in der das Gen/die Gene für Resistenz gegen P. infestans und Reifezeit lokalisiert sind. Zu diesem Zweck wurden 32 hoch resistente, spät reifende, tetraploide Sorten und 33 hoch anfällige, früh reifenden Sorten ausgewählt. Die PCR Produkte an sechs Loci auf dem Kartoffelchromosom V wurden in den 65 Sorten sequenziert und auf SNPs analysiert. In allen sechs Loci war mindestens ein SNP signifikant mit Reifezeit und mit Resistenz gegen P. infestans assoziiert. Dieses Ergebnis deutet auf ein ausgedehntes Kopplungs-Ungleichgewicht in einer genetischen Region von etwa 8 cM auf dem Kartoffelchromosom V hin.

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