Universität zu Köln

Neffgen, Carola (2006). Functional Analysis of the Dictyostelium discoideum Rho GTPases RacH and RacA. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

In this study, we investigated the functions of the two Rho GTPases RacA and RacH in Dictyostelium discoideum. Both genes are constitutively expressed and mRNA and protein are present throughout the complete developmental cycle of Dictyostelium. RacA belongs to the subfamily of Rho BTB proteins that are characterised by a modular organisation, consisting of a GTPase domain, a praline-rich region, a tandem of two BTB domains and a C-terminal region of unknown function. Thus RacA promises to be both, a highly specific adaptor molecule thanks to its BTB domains, and a regulator of signal transduction due to its GTPase domain. The particularity about RacH is that, in contrast to the other characterised Rho GTPases residing at the plasma membrane, RacH was targeted to the nuclear envelope, ER and Golgi apparatus. The pivotal process regulated by Rho GTPases is the rearrangement of the actin cytoskeleton. Therefore we investigated the role of RacA and RacH in cytoskeleton-dependent processes by analysing the performance of the respective knock out mutants in processes depending on the re-organisation of the cortical actin cytoskeleton. RacA-KO cells show conditional defects when cultured in supension: they are severly impaired in growth, cytokinesis and cell shape probably due to lowered cortical tension and F-actin distribution and reveal a slight chemotactical defect as well as reduced rates of pino- and phagocytosis. Considering the correspondence in phenotypes of cells lacking either RacA, PAKa or myosin II and the PAKa-binding by RacA, a model in which RacA acts in concert with Rac1 GTPases as a regulator of PAKa activity working in parallel to the PI3-kinase/PKB pathway that elicits PAKa activity upon chemoattractant stimulation, is proposed. Moreover putative RacA binding partners have been identified. Cells deficient in RacH have a decreased rate of fluid phase endocytosis and exocytosis and a divergent performance in the endocytosis process in comparison to the WT, but no other apparent defects. In a cell-free system RacH stimulated actin polymerisation, suggesting that it might be involved in actin-based trafficking of vesicular compartments, more specifically in the delivery of cargo to early endosomes. The lack of RacH causes defective early endocytosis leading to defects also observed at later stages of this process. By means of chimeric constructs and alanine exchange mutants it was also shown that several regions of the molecule, not only the hypervariable region, determine targeting of RacH and that targeting to the correct membrane compartment probably makes interactions with appropriate regulators and effectors possible, and is therefore essential for function.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language Functional Analysis of the Dictyostelium discoideum Rho GTPases RacH and RacA German
Translated abstract:	Abstract Language In dieser Studie wurden die Funktionen der beiden Rho GTPasen RacA und RacH in Dictyostelium discoideum untersucht. Beide Proteine werden konstitutiv, auf Transkriptions- und Proteinebene, während des gesamten Entwicklungszyklus von Dictyostelium exprimiert. RacA gehört der RhoBTB Unterfamilie der Rho GTPasen an, die eine charakteristische modulare Organisation bestehend aus einer GTPase Domäne, einer Prolin-reichen Region, zwei aufeinanderfolgenden BTB-Domänen und einer C-terminalen Region unbekannter Funktion aufweist. Aufgrund dieser Organisation verspricht RacA mittels der BTB-Domäne sowohl ein hoch spezifisches Adapter-Moekül, als auch dank der GTPase-Domäne ein Regulator-Molekül eines Signaltransduktionsweges zu sein. RacH unterscheidet sich von den bisherigen charakterisierten Rho GTPasen in Dictyotelium discoideum durch seine Lokalisierung an Endomembranen des ER und des Golgi-Apparates. Die Hauptaufgabe der Rho GTPasen, die Regulierung des Actin-Zytoskeletts, wurde hier im Fall von RacA und RacH untersucht, indem man das Verhalten von Stämmen, denen die jeweilige GTPase fehlte (KO-Stämme), in zytoskelettabhängigen Prozessen untersuchte. Kultiviert in Suspension wiesen RacA-KO Zellen konditionale Defekte auf: sie sind schwerwiegend an normalem Wachstum, Zytokinese, Zellform - wahrscheinlich bedingt durch verminderte kortikale Spannung - und F-Aktin Verteilung gehindert. Außerdem weisen sie leichte Defizite in Chemotaxis, Pino- und Phagozytose auf. Berücksichtigt man die Übereinstimmung der Phänotypen von RacA, PAKa und Myosin II defizienten Zellen und die Interaktion von PAKa und RacA, kann man ein Modell für die Regulierung des Zytoskeletts durch RacA aufstellen: RacA aktiviert wie die Rac1 GTPasen PAKa. Außerdem wird PAKa parallel noch durch einen cAMP-abhängigen Signaltransduktionweg über PI3K und PKB reguliert. Wenn also die RacA-bedingte Stimulation von PAKa aufgrund des Fehlens von RacA ausfällt, führt dies zu verminderter Myosin II Zusammenlagerung, die Abnormalitäten in Zytokinese, Chemotaxis und Zellform mit sich führt. RacH-KO Zellen weisen verminderte Endo- und Exozytoseraten und ein vom WT abweichendes Endozytoseverhalten auf, jedoch keine weiteren Defekte. In einem Zell-freien System stimuliert Rac Aktin-Polymerisierung, was darauf hinweist, daß RacH am Aktin-vermittelten Vesikeltransport mitwirkt; genauer an der Belieferung früher Endosomen. Fehlt RacH führt das zu fehlerhafter früher Endozytose, die sich auf spätere Stadien auswirkt. Mit Hilfe von chimären Konstrukten und Alanin-Austausch Mutanten konnte nachgewiesen werden, daß neben der hypervariablen Region weitere Regionen die zelluläre Lokalisation von RacH bedingen. Außerdem konnte gezeigt werden, daß die korrekte zelluläre Lokalisation Interaktionen mit geeigneten Regulatoren und Effektoren ermöglicht und somit essentiell für die Funktion von RacH ist. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Neffgen, Carola carola.neffgen@uni-koeln.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-16895
Date:	2006
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Medicine > Biochemie > Institut I für Biochemie
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Dictyostelium , RhoGTPases , endocytosis English
Date of oral exam:	6 February 2006
Referee:	Name Academic Title Noegel, Angelika Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/1689