In vitro und in vivo Studien zur Charakterisierung von Testican-2 und SMOC-1, zweier neuer Mitglieder der BM-40 Familie

Heep, Detlef (2005). In vitro und in vivo Studien zur Charakterisierung von Testican-2 und SMOC-1, zweier neuer Mitglieder der BM-40 Familie. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

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Abstract

Testicane (Testican-1, -2, und �3) sind Proteoglykane, die aufgrund ihrer Domänenstruktur der BM-40 Familie sekretierter, Calcium bindender Proteine zugeordnet werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Mäuse generiert, in denen das Gen für Testican-2 mittels homologer Rekombination inaktiviert wurde. Die Tiere sind lebensfähig und unterscheiden sich weder in Körpergewicht und �form noch hinsichtlich der Morphologie der inneren Organe von Wildtyp Mäusen. Allerdings ist die Fertilität Testican-2 defizienter Mäuse vermindert. So führen Verpaarungen zweier Testican-2 defizienter Tiere zu signifikant kleineren Würfen als Verpaarungen, in denen nur ein Elterntier homozygot für das mutierte Allel ist, oder Verpaarungen von heterozygoten Tieren. Die Histologie von Testikeln, Gehirnen, Bauchspeicheldrüsen und Nebennieren war in Testican-2 defizienten Mäusen nicht von der aus Wildtyp Mäusen zu unterscheiden. Im Herz, im dem Testican-2 schon in frühen Embryonalstadien exprimiert wird, waren in Testican-2 defizienten Mäusen dilatierte Ventrikel und dünnere Herzwände zu beobachten. Ein solcher Phänotyp entspricht dem Krankheitsbild einer dilatierten Kardiomyopathie. In der Lunge gibt es ebenfalls Hinweise auf eine veränderte Histologie in Form vergrößerter Alveolen. Außerdem wurde die Expression und mögliche Funktion eines Mikro-Exons untersucht, das in allen Testicanen für die drei Aminosäuren Glu-Val-Glu (EVE) in der Testican spezifischen aminotermianlen Domäne kodiert. Es konnte gezeigt werden, dass im Gegensatz zu Testican-1 und �3 für Testican-2 sowohl im Mensch als auch in der Maus fast ausschließlich Isoformen mit diesem Exon existieren. Rekombinante Expression beider Isoformen in eukaryontischen Zellen und anschließende biochemische Analyse weisen auf eine Funktion der EVE Sequenz als proteolytische Spaltstelle hin. Die Natur der verantwortlichen Protease ist bisher unbekannt. Zusätzlich wurde in dieser Arbeit mit SMOC-1 ein weiteres Mitglied der BM-40 Familie untersucht. SMOC-1 ist ein Glykoprotein und wurde in Vorarbeiten als integraler Bestandteil fast aller Basalmembranen identifiziert. Deshalb wurden gezielt Interaktionen von SMOC-1 mit anderen Basalmembranproteinen untersucht. Im Luminex System konnte Laminin-1 und das Perlecanfragment PIV-1 als Interaktionspartner ermittelt werden. Beide Interaktionen wurden mittels Oberflächen Plasmon Resonanz bestätigt.

Item Type:

Thesis (PhD thesis)

Translated abstract:

Abstract

Language

Testicans (testican-1, -2 and �3) are proteoclycans which, by structure, are assigned to the BM-40 family of secreted, calcium binding proteins. Here, mice were generated, in which the gene for testican-2 was inactivated by homologous recombination. Animals are viable and do not differ from their wildtype littermates with regard to body weight and -shape or morphology of the inner organs. However, their fertility appears reduced, as mating of two testican-2 deficient mice lead to significantly decreased litter sizes compared to matings of mice, where only one animal is homozygous for the testican-2 mutant allele, or matings of heterozygous mice. Histological comparison did not show any obvious differences for brain, testis and endocrinal glands like adrenal gland or pancreas between knock-out and wildtype mice. However, the hearts of testican-2 deficient mice show dilated ventricles and a reduced diameter of the myocard. This phenotype corresponds to a pathophysiological condition dilated cardiomyopathy. The lungs of animals with mutated testican-2 appear to have somewhat enlarged alveoli. In addition, the expression and possible functions of a micro exon was analysed, which in all testicans codes for the amino acids EVE in the testican-specific first domain. In contrast to testican-1 and �3, in case of testican-2 the isoform containing this exon was almost exclusively detected both in mouse and man. Recombinant expression of both isoforms in eucaryotic cells and subsequent biochemical analysis revealed that the sequence functions as proteolytic cleavage site. So far the nature of the cleaving protease is not known. Furthermore, SMOC-1, another member of the BM-40 family, was investigated. SMOC-1 is a glycoprotein and was shown to be an integral component of most basement membranes. Binding of recombinant SMOC-1 to other components of basement membranes was specifically analysed. Using the Luminex system laminin-1 as well as the perlecan fragment PIV-1 could be identified as binding partners. The results could be verified by surface plasmon resonance measurements.

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