Universität zu Köln

Rufer, Arne Christian (2006). Insulin receptor, AMPK and CPT-2: Crystallization experiments and structural characterization of three proteins relevant to diabetes mellitus. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Impaired insulin signaling due to peripheral insulin resistance and failure of pancreatic insulin secretion is a key factor for the onset and manifestation of type 2 diabetes mellitus (T2D). Insulin receptor (IR) agonists are being developed to restore insulin signaling via direct activation of the cytoplasmic insulin receptor tyrosine kinase activity. Two classes of such compounds have been developed by the pharmaceutical companies Merck & Co., Inc., and Telik, Inc., but in patents and literature there is no data as to how these compounds activate the IR kinase activity. Attempts to solve the crystal structures of dimeric human IR kinase domains and complexes of these with IR agonists within this thesis failed. However, biophysical characterization of the full-length intracellular part of the IR containing the kinase domain demonstrated an intrinsic ability to dimerize independently of the enzyme-substrate type of interaction seen in IR autophosphorylation. This dimer formation was found to be enhanced in the presence of a distinct IR agonist. Crystals of various constructs and isoforms of the key antidiabetic target AMP-activated protein kinase (AMPK) were obtained. Despite substantial optimization trials these crystals were not sufficient for solving the structure of AMPK. However, the crystal structure of carnitine palmitoyltransferase 2 (CPT-2), a protein downstream of the metabolite signaling initiated by AMPK, was solved. CPT-1 and -2 facilitate the import of long-chain fatty acids into mitochondria. Modulation of the catalytic activity of the CPT system is currently under investigation for the development of novel drugs against diabetes mellitus. The crystal structure of the full-length mitochondrial membrane protein CPT-2 was solved at a resolution of 1.6 Å. The structure of CPT-2 in complex with the generic CPT-inhibitor ST1326 [(R)-N-tetradecylcarbamoyl-aminocarnitine], a substrate analog mimicking palmitoylcarnitine and currently in clinical trials for T2D treatment, was solved at 2.5 Å resolution. These structures of CPT-2 provide insight into the function of residues involved in substrate binding and determination of substrate specificity, thereby facilitating the rational design of novel antidiabetic drugs. A sequence insertion uniquely found in CPT-2 was identified that mediates membrane localization. Mapping of mutations described for CPT-2 deficiency, a hereditary disorder of lipid metabolism, implies effects on substrate recognition and structural integrity of CPT-2.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language Insulinrezeptor, AMPK und CPT-2: Kristallisationsexperimente und strukturelle Charakterisierung von drei Diabetes mellitus-relevanten Proteinen German
Translated abstract:	Abstract Language Eingeschränkte Insulinwirkung aufgrund peripherer Insulinresistenz oder unzureichender pankreatischer Insulinsekretion ist ein entscheidender Faktor für die Entstehung und Manifestation von Typ 2 Diabetes mellitus (T2D). Es befinden sich Insulin Rezeptor (IR) Agonisten in der Entwicklung, welche die cytoplasmatische IR Kinaseaktivität direkt aktivieren. Zwei Klassen solcher Verbindungen wurden von den pharmazeutischen Unternehmen Merck & Co., Inc., und Telik, Inc., entwickelt, aber weder in Patenten noch in der Literatur befinden sich Angaben, wie diese Verbindungen die Kinaseaktivität des IR aktivieren. Versuche, die Kristallstruktur dimerer IR Kinasedomänen oder von Komplexen derselben mit IR Agonisten innerhalb dieser Dissertation zu lösen, sind fehlgeschlagen. Allerdings zeigte die biophysikalische Charakterisierung des gesamten intrazellularen Abschnitts des IR einschließlich der Kinasedomäne ein intrinsisches Vermögen, unabhängig von den Enzym-Substrat-Wechselwirkungen der Autophosphorylierung zu dimerisieren. Die Ausbildung dieses Dimers wird durch die Anwesenheit eines spezifischen IR Agonisten verstärkt Kristalle verschiedener Konstrukte und Isoformen der AMP-aktivierten Proteinkinase (AMPK), einem wichtigen Zielmolekül für potentielle antidiabetische Substanzen, konnten gezüchtet werden. Trotz ausgiebiger Optimierungsversuche waren diese Kristalle nicht hinreichend für die Lösung der Kristallstruktur der AMPK. Die Kristallstruktur der Carnitinpalmitoyltransferase 2 (CPT-2), ein Protein in der durch AMPK ausgelösten Metaboliten-Signalkaskade, konnte dagegen gelöst werden. CPT-1 und -2 importienen langkettige Fettsäuren in Mitochondrien. Die Modulation der katalytischen Aktivität des CPT-Systems wird derzeit für die Entwicklung von neuartigen Medikamenten gegen T2D untersucht. Die Kristallstruktur des vollständigen mitochondrialen Membranproteins CPT-2 konnte mit einer Auflösung von 1.6 Å gelöst werden. Die Struktur von CPT-2 im Komplex mit dem generischen CPT-inhibitor ST1326 [(R)-N-Tetradecylcarbamoylaminocarnitine], einem Palmitoylcarnitin-nachahmendes Substratanalogon, derzeit in klinischen Studien für die Behandlung von T2D, wurde mit einer Auflösung von 2.5 Å gelöst. Diese Strukturen gewähren Einsicht in die Funktion von Aminosäuren, die in die Bindung von Substrat und die Determination der Substratspezifität involviert sind, und erlauben somit die Entwicklung neuartiger antidiabetischer Wirkstoffe. Eine Insertion in der Sequenz der CPT-2 vermittelt die Membranlokalisation. Die Kartierung der für die CPT-2 Defizienz (eine vererbte Fettstoffwechselstörung) beschrieben Mutationen impliziert Effekte auf Substraterkennung und strukturelle Integrität der CPT-2. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Rufer, Arne Christian arne.rufer@roche.com UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-17422
Date:	2006
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Chemistry > Institute of Biochemistry
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Insulinrezeptor , AMPK , CPT-2 , Proteinkristallographie , Röntgenstrukturanalyse German insulin receptor , AMPK , CPT-2 , protein crystallography , X-ray structure analysis English
Date of oral exam:	5 February 2006
Referee:	Name Academic Title Klein, Helmut W. Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/1742