Universität zu Köln

Czepe, Carmen (2005). Using microarray analysis to find novel genes involved in somitogenesis. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

During the development of vertebrates the body is subdivided into repeated units, the somites. They are generated from the presomitic mesoderm (PSM) and are flanking the notochord on both sides. For this coordinated process components of the Delta-Notch signalling pathway are important. Novel genes involved in somitogenesis were searched using microarray-technology. This technique had to be established in the lab and this was done using a cDNA library, which was prepared from embryos of mixed embryogenesis stages. The basic protocols were established like printing, labelling and hybridisation. The usage of spiked in controls was established as well. The controls were genes from the bacteriophage lambda. Later the cDNA library was used to compare the expression of wt and fss embryos. The fss mutant is linked to the gene Tbx24, which is no component of the Delta-Notch pathway, but belongs to the fused somite type mutants. To compare the other fused somite type embryos against wt the zebrafish oligo library from Sigma-Genosys was used. The other mutants are des, bea and aei. These mutants are defective in components of the Delta-Notch pathway, des in notch1a, bea in deltaC and aei in deltaD. As these components are involved in the starting of the cascade and because of this some rescue mechanisms might occur the mediator of the pathway Su(H) was used as well. For this gene morpholino knock down embryos were produced. The PSM consists of several compartments, namely a posterior, an intermediate and an anterior compartment. The PSM of the zebrafish was not dissected in these parts, as it is very small. The PSM of the mouse is bigger and therefore it was cut in an anterior and a posterior part, where the anterior part contains the intermediate and the anterior compartment. For this approach the mouse oligo library from Sigma-Genosys was used. The candidate genes found in these screens had to be validated by another method. The in situ hybridisation was chosen, as this allows the localisation of the expression and validation. For the mouse PSM screen this method was not used. Here the literature was scanned to find the expression pattern of the genes found. Doing this validated two candidates from this approach. The genes found in the zebrafish screens were validated using the in situ hybridisation. Genes with an interesting expression pattern will be further characterised, i.e. their functional role in somitogenesis will be elucidated.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language Die Verwendung der Microarraytechnologie um neue Gene der Somitogenese zu finden German
Translated abstract:	Abstract Language Während der Entwicklung der Vertebraten wird der Körper in sich wiederholende Einheiten unterteilt, die sogenannten Somiten. Diese werden von dem präsomitischen paraxialen Mesoderm (PSM) gebildet und flankieren das Notochord zu beiden Seiten. Für den koordinierten Ablauf dieses Prozesses ist die Expression von Komponenten des Delta-Notch- Signaltransduktionsweges wichtig. Um neue Gene, die eine Rolle in der Somitogenese zu finden, wurde die Mikroarraytechnologie verwendet, die allerdings zunaechst noch etalbiert werden musste. Dafür wurde eine cDNA Bank verwendet, die aus Embryonen in verschiedenen Entwicklungsstadien hergestellt wurde. Die grundlegenden Protokolle, wie Printen, Markieren und Hybridisierung, wurden mit dieser Bank etabliert. Die Verwendung von zugegebenen Kontrollen wurde ebenfalls eingeführt. Diese Kontrollen waren Gene des Bakteriophagen Lambda. Danach wurde diese Bank verwendet um die Expression zwischen wt und fss Embryonen zu vergleichen. Die fss-Mutante ist in dem Gen Tbx24 defekt. Dieses Gen gehört nicht zum Delta-Notch Signalweg, aber zu den fused somite type Mutanten. Die Zebrafisch oligo Bank von Sigma-Genosys wurde für den Vergleich der fused somite type Mutanten mit den Wildtypembryonen herangezogen. Die Mutanten die noch zu dieser Klasse gehören sind des, bea und aei. Diese Mutanten haben Defekte in Komponenten des Delta-Notch Signalweges, des in notch1a, bea in deltaC und aei in deltaD. Da diese Komponenten am Beginn der Kaskade stehen und da es deshalb sehr wahrscheinlich ist das andere Teile der Kaskade einspringen könnten, wurde der Mediator des Signalweges, Su(H) ebenfalls verwendet. Für dieses Gen wurden Morpholino knock down Embryos erzeugt. Das PSM besteht aus mehreren Teilen, nämlich dem posterioren, dem intermediären und dem anterioren Kompartment. Das PSM des Zebrafisches wurde nicht in diese Teile zerschnitten, da es sehr klein ist. Das PSM der Maus ist grösser und deshalb wurde es hier in einen anterioren und einen posterioren Anteil geteilt, wobei der anteriore Teil das anteriore und das intermediäre Kompartment umfasste. Für diesen Ansatz wurde die Maus Oligo Bank von Sigma-Genosys verwendet. Die Kandidatengene die in diesen Versuchen gefunden wurden, muβten noch durch eine andere Methode überprüft werden. Die in situ Hybridisierung wurde ausgewählt, da sie zusätzlich zur Validierung auch eine Lokalisierung der Expression erlaubt. Für den Maus-PSM Screen wurde diese Methode allerdings nicht verwendet. In diesem Fall wurde in der Literatur nach Expressionsmustern der gefundenen Gene gesucht. Zwei Kandidaten wurden auf diese Art und Weise überprüft. Die Gene, die in den Zebrafischversuchen entdeckt wurden, wurden durch die in situ Hybridisierung validiert. Gene, die ein interessantes Expressionsmuster zeigen werden weiter charakterisiert, das heiβt ihre funktionelle Rolle in der Somitogenese wird untersucht werden. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Czepe, Carmen Carmen@czepe.at UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-17634
Date:	2005
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Biology > Institute for Genetics
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Microarray, somitogenesis English
Date of oral exam:	30 November 2005
Referee:	Name Academic Title Tautz, Diethard Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/1763