Methodische Evaluierung von Methoden zur Analyse des Mucin-Typ O-Glykoproteoms

Teitz, Sebastian Bernhard (2006). Methodische Evaluierung von Methoden zur Analyse des Mucin-Typ O-Glykoproteoms. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

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Abstract

Die Glykosylierung von Proteinen ist die am weitesten verbreitete Post-translationale Modifikation und Glykoproteine spielen grundlegende Rollen in mannigfaltigen biologischen Prozessen. Die Entwicklung von Analysetechniken, die Glykosylierungsmusteren und deren Variation erfassen, wird durch die heterogene und komplexe Natur dieser PTM beeinträchtigt. Die Analyse wird durch die Komplexität von Glykanen eingeschränkt und durch die verschiedenen Unterarten der Glykosylierung. Einer der häufigsten Subtypen ist die N-Glykosylierung, die mit N-Acetylglukosamin am Stickstoffatom von Asn initiiert wird . Eine weitere Form, die O-Glykosylierung, findet am Sauerstoffatom von Ser/Thr statt. Vor weniger häufigen Formen der O-Glykosylierung, wie O-Fucosylierung oder O-Mannosylierung, ist die O-Glykosylierung des Mucin-Typs, initiiert durch N-Acetylgalaktosamin die quantitativ vorherrschende Form. Speziell diese Mucin-Typ glykosylierten Proteine stellen eine methodische Herausforderung in der Proteom-Analytik dar, weil konventionelle Färbemethoden in der PAGE oft nicht ausreichen, um diese darzustellen, dichter O-glykosidischer Besatz eine enzymatische Proteolyse in sequenzierbare Peptide stark einschränkt und bei Glykopeptiden, aufgrund ihrer Heterogenität und Polarität, die Identifizierbarkeit durch MS-Techniken eingeschränkt ist. Nach Datenbankeinträgen werden etwa 10% aller Proteine als O-Glykoproteine identifiziert. Dies sind Extrapolationen, da für die GalNAc- Glykosylierung kein Sequenzmotiv, wie im Fall der N-Glykosylierung, besteht. Die GalNAc-Glykosylierung wird von mindestens 15 verschiedenen Polypeptid-GalNAc-Transferasen mit unterschiedlichen Expressionsmustern und überlappenden Substratspezifitäten, initiiert. Vor diesem Hintergrund sollten in der vorliegenden Arbeit Strategien evaluiert werden, welche die Analyse von Mucin-Typ glykosylierten Proteinen verbessern und Strategien zur Analyse des O-Glykoproteoms etabliert werden. Hier handelt es sich z.T. um Adaptionen von Techniken, die im Kontext von Analysen anderer Glykosylierungs-Typen publiziert wurden, und z.T. um eigene neue Strategien. Weitere Ansätze sollten auf die Kompatibiltät mit Standard-Proteomanalyse-Strategien überprüft werden. Die einzige evaluierte in-vivo Technik �Metabolische in-vivo-Markierung von Glykoproteinen mit Azidozuckern� ist eine robuste Methode zur Identifizierung glykosylierter Proteine und bietet ein Hilfsmittel für Proteomik-Studien im Zusammenhang mit der Glykosylierung. Die metabolische Markierung von Glykoproteinen wird in der kommenden Zeit wahrscheinlich große Bedeutung erlangen. Hier stehen noch methodische Verbesserungen aus, die eingehende Studien von Glykosylierungen des Mucin-Typs in Zell- bzw. Gewebearten ermöglichen, die bisher nicht oder nur schwach markiert werden konnten. Reduktive Methoden, die eine Eliminierung von Glykanen und deren Substitution durch eine spezifische Markierung verfolgen, leiden z.T unter diversen Nachteilen. So wurden z.B. umfangreiche Degradierungen von Peptiden unter den gewählten Bedingungen nachgewiesen. Weitaus schwerwiegender als eine Degradierung ist, daß es zu falsch-positiven Markierungen von unglykosylierten AS kommt, dies bereits unter Reaktionsbedingungen, die keine quantitative Eliminierung von Glykanen gewährleisten. Die E-Eliminierung von O-Glykanen und Addition von Alkylaminen weist nicht die Nachteile anderer reduktiver Ansätze, nämlich ausgeprägte Degradierung und fehlerhafte Markierung unglykosylierter AS auf. Vorteile, die über bereits bekannte hinausgehen, nämlich die verbesserte in-Gel-Proteolyse und Massenspektrometrische Identifizierbarkeit, konnten nicht gezeigt werden. Die Alkylamin-Behandlung konnte nicht auf eine Kompatibilität mit PAGE-Techniken hin optimiert werden, so daß technische Schwierigkeiten, wie die Darstellung glykosylierter Proteine, erhalten bleiben. Strategien, die eine quantitative Anreicherung von Glykoproteinen bzw. O-Glykoproteinen verfolgen, wiesen erhebliche Nachteile in Bezug auf Spezifität und Avidität (Hydrophile Affinitätschromatographie und Fraktionierung auf Aminophenylboratsäulen) auf bzw. zeigten eine verfrühte Freisetzung des glykosylierten Analyts (Identifizierung von O-Glykoproteinen per Hydrazidchemie und Massenspektrometrie). Die partielle Deglykosylierung von Glykoproteinen und �peptiden mit TFMSA hat ihren Wert in der Analyse eines gereinigt vorliegenden Glykoproteins bestätigt, weist aber keine Kompatibilität mit PAGE-Techniken auf. Ferner hat die nachgeschaltete Chromatographie auf HPA-Agarose Nachteile im Bezug auf die Avidität der Substrat-Bindung. Eine Färbemethode, die eine selektive Detektion von 5 ZUSAMMENFASSUNG 114 Glykoproteinen über Fluoreszenz in Gelen und in Western-Blots ermöglichen sollte, konnte wegen mangelnder Spezifität und Sensitivität der Färbung nicht umgesetzt werden. Eine universell anwendbare Methode für Proteom-Analysen des Mucin-Typ O-Glykoproteoms mit in-vitro-Markierung glykosylierter AS sollte folgende Eigenschaften aufweisen: -Selektive Substitution von O-Glykanen und Reduktion der Komplexität auf eine einheitliche Markierung, bei ausgeschlossenen falsch-positiven Resultaten. -Möglichkeit zu 2D-PAGE-Analysen und Darstellung mit gängigen Färbetechniken im Gel. -Verbesserung von enzymatischen Umsetzungen vormals O-glykosylierter Proteine auf quantitativem Niveau. -Die Markierung sollte die quantitative chromatographische Anreicherung vormals O-glykosylierter Proteine vor/nach deren Proteolyse ermöglichen. -Verbesserung der Identifizierbarkeit mit massenspektrometrischen Techniken. Eine Methode, die alle oben genannten Aspekte in vollem Umfang gewährleistet, existiert bis dato nicht. In der vorliegenden Arbeit wurden aber Erkenntnisse und Daten gewonnen, die Aussagen über die Umsetzbarkeit bzw. das Potential diverser Strategien im Bezug auf die genannten Aspekte zulassen. Dies sollte eine Etablierung von Methoden und Strategien für Studien im Kontext des Mucin-Typ-Glykoproteoms erleichtern.

Item Type:

Thesis (PhD thesis)

Creators: