Analyse der Expression und Funktion von SMOC-1 und SMOC-2 - Kölner UniversitätsPublikationsServer

Maier, Silke (2006). Analyse der Expression und Funktion von SMOC-1 und SMOC-2. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

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Abstract

Die beiden extrazellulären Matrixproteine SMOC-1 und SMOC-2 wurden sowohl komplett als auch in Fragmenten kloniert, die einzelne oder die Kombination von drei oder vier Domänen enthielten. Die Proteine wurden in eukaryontischen Zellen rekombinant hergestellt und über Affinitätschromatographie aufgereinigt. So konnten sie für funktionelle Studien und zur Antikörper-Herstellung eingesetzt werden. Auch wurde mit dem rekombinanten Protein ein Antiserum gegen SMOC-2 affinitätsgereinigt und zur Analyse der Expression von SMOC-2 im Gewebe verwendet. In der adulten Maus wurde SMOC-2 hauptsächlich in Herz, Milz, Thymus, Ovar, vor allem aber auch in Lunge, Niere, Knorpel und Haut exprimiert. In der Embryonalentwicklung begann die SMOC-2 Expression an Tag 7,5 in Basalmembranen, war aber nicht auf diese beschränkt. Ab Tag 10,5 wurde die Verteilung breiter und SMOC-2 blieb kontinuierlich bis ins adulte Tier erhalten. Auch im Zebrafisch spielten die SMOCs schon in sehr frühen Stadien der Embryonalentwicklung, wie z.B. der Gastrulation und Segmentierung, eine Rolle. Nach der Inhibition der Translation von SMOC-1 durch Morpholino Knockdown-Experimente oder bei Überexpression in Folge der Injektion von SMOC-1 mRNA, wiesen die Tiere schon 12 hpf morphologische Veränderungen auf. Diese äußerten sich in einem vergrößerten Kopf-Schwanz-Abstand und zu späteren Entwicklungsstadien in einem missgebildeten posterioren Körperbereich und einem verkrümmten Schwanz. Diese Knockdown-Phänotypen konnten durch Koinjektion von SMOC-1 Morpholino und mRNA aufgehoben werden. Im weiteren Verlauf der Entwicklung verursachte die Injektion von SMOC-1 oder SMOC-2 Morpholinos allein oder in Kombination weitere schwere Anomalien wie Perikardialödeme und Probleme des Blutgefäßsystems. Diese konnten auf eine fehlerhafte Barrierefunktion von Epithelien zurückgeführt werden. So war neben der Haut auch Endothelgewebe in seiner Funktion beeinträchtigt. Die Rolle von SMOC-1 und SMOC-2 für die Funktion der Haut wurde in vitro, ex vivo und in vivo untersucht. Dabei wurde eine verstärkte Zelladhäsion von Hautzellen an die extrazelluläre Domäne von SMOC-1 und SMOC-2 festgestellt, die über alpha-v/beta-6 Integrin vermittelt wurde. Damit war der Hauptrezeptor beider SMOCs identifiziert, über dessen Verteilung und Funktion weitere mögliche Rollen der SMOCs postuliert werden konnten. So förderten sie in vitro das Migrationsverhalten von Keratinozyten, beeinflussten deren Proliferation aber nicht. In vivo wurde SMOC-2 von basalen Keratinozyten exprimiert und kolokalisierte mit Cytokeratin-14 in der Epidermis. Hier spielte das Protein auch eine Rolle beim Prozess der Reepithelialisierung im Verlauf der Wundheilung.

Item Type:

Thesis (PhD thesis)

Translated title:

Title	Language
Analysis of expression and function of SMOC-1 and SMOC-2	English

Translated abstract:

Abstract

Language

SMOC-1 and SMOC-2, two extracellular matrix proteins, were cloned as full length proteins but also as fragments that contained only single domains or the combination of three or four domains. The proteins were recombinantly expressed in eukaryotic cell lines, purified by affinity chromatography and used to immunize animals or to perform functional assays. An antiserum against SMOC-2 could be affinity purified with the help of the new recombinant proteins, which allowed the analysis of expression and tissue distribution of SMOC-2. In adult mouse, heart, spleen, thymus, ovary and, particularly, lung, kidney, cartilage and skin were found to be the organs where SMOC-2 is mainly expressed. During embryonic development SMOC-2 was first detected at basement membranes at embryonic day 7.5, but the expression was not limited to these structures. Starting at day 10.5 the distribution became broader and SMOC-2 was continuously present until adulthood. In zebrafish, the SMOCs were shown to be important even for very early stages of embryonic development, i.e. gastrulation and segmentation. If SMOC-1 translation was inhibited in morpholino knockdown experiments, or if SMOC-1 was overexpressed as a consequence of mRNA injection, the animals showed morphological changes already at 12 hpf. Abnormalities like an increased head-to-tail distance and, at later developmental stages, deformed posterior body segments and a kinky tail were found. The knockdown phenotypes could be rescued by coinjection of SMOC-1 morpholino with SMOC-1 mRNA. Injection of SMOC-1 or SMOC-2 morpholinos alone or in combination caused other severe developmental abnormalities, e.g. pericardial edema formation and irregularities in the vascularization. These failures were due to a defect in epithelial barrier function. The skin was affected and also endothelia became nonfunctional. The role of SMOC-1 and SMOC-2 in skin function was studied in vitro, ex vivo and in vivo. Keratinocyte cell attachment was promoted by the extracellular calcium-binding domain of SMOC-1 or SMOC-2, an interaction mediated by alpha-v/beta-6 integrin. This integrin seems to be the major receptor for both SMOCs, a result which was supported by codistribution studies. Furthermore, the SMOCs supported migration of HaCaT keratinocytes in vitro, but did not influence their proliferation. In vivo, SMOC-2 was expressed by basal keratinocytes and colocalized with cytokeratin-14 in the epidermis. Here, it plays a role in the reepithelialization process during wound healing.

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