Universität zu Köln

Sattarzadeh Mohammadi, Amirali (2006). Identification and functional characterization of cargo binding sites of plant myosins. PhD thesis, Universität zu Köln.

Preview

PDF PhD_thesis_Amir.pdf Download (19MB)

Abstract

Myosins are actin-based molecular motors of eucaryotic organisms that play fundamental roles in many forms of motility. In addition to the well known muscle myosin a large number of myosins exist, that are essential for movement at the cellular and subcellular level. Such processes are for instance cell migration, cytokinesis, endo-/phagocytosis, exocytosis, growth cone extension, remodelling of cell shape and morphology, and organelle/particle trafficing. More recent evidence implicates myosins as important actors even in processes such as signal transduction and polymerization of actin. Based on alignment and tree production by comparing the core motor domain sequences of the myosins (myosin heavy chains) from the public databases, all known myosins were grouped into 17 or 18 classes. Remarkably, the myosins from higher plants exclusively fall into two classes, VIII and XI. In an additional class, class XIII, myosins from the alga Acetabularia cliftonii are grouped. Knowledge about structure and in particular about function of plant myosins is very limited. Major sources of information about higher plant myosin genes are the completed genome sequences of the model plants Arabidopsis thaliana and Oryza sativa (rice). 17 myosin genes were identified in the Arabidopsis genome, 4 of them belong to class VIII and 13 to class XI; the rice genome encodes for 14 genes (2 class VIII and 12 class XI). Besides the fact that plant myosins appear to form a clade of their own, the available sequence data nevertheless suggest that they follow the domain pattern typical for all myosins: the highly conserved N-terminal head (motor) domain responsible for ATP hydrolysis, binding to actin and production of force, the neck domain containing characteristic repeat motifs (IQ repeats), and the C-terminal tail domain. The IQ motifs of the neck domain are binding sites for calmodulin or regulatory light chains, which are unknown for plant myosins. The tail domain usually contains one or more coiled-coil regions responsible for dimerization. In the case of class XI myosins the tail domain contains additionally the DIL domain at the C-terminal end. In mammals and yeast this domain is present in class V myosins. Data from yeast shed light on its function, since it was demonstrated that this domain contains a distinct binding region for movement of vesicular cargo. However, cargo binding sites must not necessarily be localized only within the DIL domain, since also in yeast another region, putatively binding vacuoles, was found considerably upstream. In this dissertation a survey of the subcellular localization, the dynamic behavior, the transported cargoes and their potential binding site(s) in myosin tails was obtained. For this investigation transient overexpression of selected A. thaliana class VIII and XI myosins and a variety of respective subregions fused to fluorescent proteins as markers was used as assay system. The approach combined high resolution in vivo microscopy, molecular biology and in vivo biochemistry. Such an integrated approach was so far not applied for plant myosins. The data showed that specific binding sites for Golgi stacks/vesicles and peroxisomes which are highly conserved among all A. thaliana class XI myosins reside within the C-terminal part of class XI myosins (DIL domain). In addition, studying the tail domain of barely class XI myosins revealed that the identified cargo binding sites are highly conserved in monocots and dicots. The peroxisomal localization of the DIL domain of the yeast myosin V (Myo2p) in plant cells was a strong indication for the involvement of the DIL domain as cargo binding site among class V and XI myosins. The phenotypic characterization of 10 out of 13 class XI homozygous knock-out lines revealed no drastic effects with respect to growth and development or pathogen defence. Only various degrees of stunted growth, changes in seed morphology and a slight increase in susceptibility to bacterial infection were observed. Alltogether, these results demonstrate considerable functional redundancy among class XI myosins. For two selected class VIII myosins (ATM1 and ATM2), each as a representative for one myosin VIII subclass, it appeared that only ATM2 localized on vesicles which later showed partial colocalization with endosomes. The detailed analysis of the ATM2 tail domain showed that in contrast to class XI myosins, ATM2 probably binds only one cargo. For the involvement of ATM2 in such an important process like endocytosis would also speak the fact that the homozygous knock out of this gene results in lethality. The other class VIII myosin investigated, ATM1, showed plasma membrane localization in agreement with previous studies where by immunocytochemistry this myosin was found in the cell plate associated with the plasma membrane in particular at plasmodesmata. These data suggest a role in the formation of the new cell wall and the generation and maintenance of plasmodesmata. Thus, the functions of class VIII myosins might be quite diverse.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language Identifizierung und Funktional Untersuchungen der Bindungsstellen den pflanzen myosins German Identification and functional characterization of cargo binding sites of plant myosins English
Translated abstract:	Abstract Language Myosine sind Aktin-abhängige Motorproteine, die in allen Eukaryonten vorkommen und in grundlegenden Funktionen wie Zellmotilität, intrazellulärer Transport, Signalübermittlung, Zellteilung und Morphogenese eine zentrale Rolle spielen. Über Myosine bei Pflanzen ist wenig bekannt, besonders hinsichtlich ihrer zellulären Funktionen. Auf jeden Fall bilden sie eine eigene Gruppe und gehören den Klassen VIII und XI der insgesamt 18 Klassen der Myosin-Superfamilie an. Die verfügbaren Sequenzdaten lassen vermuten, dass die Struktur der pflanzlichen Myosine dem myosintypischen Muster folgt: die hochkonservierte N-terminale Kopf (head)- oder Motordomäne, verantwortlich für ATP-Hydrolyse und die damit verbundene Bewegung entlang Aktinfilamenten, die Hals (neck-)domäne für die Kraft-bzw. Bewegungsübertragung und -Verstärkung und die Bindung von regulatorischen Proteinen wie z. BSP Calmodulin, sowie die Schwanz-(tail-)domäne, die gewöhnlich für Dimerisierung und an ihrem C-terminalen Ende für die Bindung an "Cargo" verantwortlich ist. In der vorliegenden Doktorarbeit wurde ein erster Überblick über die subzelluläre Lokalisation und deren Dynamik sowie die Art des transportierten Cargos und die Bindungsstellen in den Schwanzregionen pflanzlicher Myosine erarbeitet. Für diese Untersuchungen wurde als Testsystem transiente Überexpression in Verbindung mit Fluoreszenzprotein-Markierungstechnologie an ausgewählten Myosinen und einer Anzahl ihrer verschiedenen Unterregionen und Domänen verwendet. Ein derartig integrierter Versuchsansatz wurde für pflanzliche Myosine bisher nicht eingesetzt. Die Resultate zeigten, dass in der C-terminalen Region von Myosinen der Klasse XI spezifische Bindungsstellen für Peroxisomen und Golgi Stapel/Vesikel zu finden sind, vorwiegend im C-terminalen Teil, der sogenannten DIL Domäne. Es stellte sich heraus, dass diese Region und die Bindungsstellen innerhalb der Klasse XI untereinander und zwischen verschiedenen Pflanzen stark konserviert sind. Sogar die Bindungsstelle des homologen Myosins aus Hefe, Myosin V (Myo2p) funktionierte in Pflanzenzellen als Bindungsstelle zu Peroxisomen. Dies lässt die Schlussfolgerung zu, dass die pflanzlichen Myosine der Klasse XI in Organelltransport (Golgiapparat, Peroxisomen) involviert sind, wobei gewisse Redundanz vorliegt. In Funktion und Struktur sind die Myosine der Klasse XI den pilzlichen und tierischen Myosinen der Klasse V am ähnlichsten. Für zwei ausgewählte Vertreter (ATM2, ATM1) der anderen Klasse pflanzlicher Myosine, der Klasse VIII, zeigte nur ATM2 Bindungskapazität an Vesikel, die teilweise mit Endosomen kolokalisierten. Man kann auf Grund der Daten annehmen, dass ATM2 in der pflanzlichen Endozytose eine Rolle spielt, allerdings bleibt unklar an welcher Stelle im Gesamtprozess. Für die Beteiligung an einem solch wichtigen Geschehen wie Endozytose würde auch der Befund sprechen, dass homozygote knock-out Pflanzen in diesem Gen nicht keimungsfähig und damit nicht lebensfähig sind. Das untersuchte zweite Myosin der Klasse VIII, ATM1, war eng mit der Plasmamembran assoziert und zeigte keinerlei vesiculäre Lokalisierung. Dieses Ergebnis ist in Übereinstimmung mit publizierten Lokalisierungen, die mit Immunocytologie erhoben wurden. Hier war Bindung an Plasmamembran, vorwiegend im Bereich von Plasmodesmata, in der sich neu entwickelnden Zellplatte nach Zellteilung gefunden worden. Dies spricht für eine Funktion von ATM2 bei der Bildung der neuen transversalen Zellwand und ihrer Zell-Zellverbindungen (Plasmodesmata). Die Funktionen der Myosine der Klasse VIII sind daher wahrscheinlich recht verschieden. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Sattarzadeh Mohammadi, Amirali asattarzadeh@gmail.com UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-18897
Date:	2006
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Biology > Institute for Genetics
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Pflanzen Myosin , Molekulare Motors German plant myosin, molecular motors English
Date of oral exam:	29 October 2006
Referee:	Name Academic Title Schulze-Lefert, Paul Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/1889