Universität zu Köln

Tscharntke, Michael (2006). Funktionale Charakterisierung von Rac1 in der epidermalen Wundheilung in vivo und in vitro. PhD thesis, Universität zu Köln.

Preview

PDF Dissertation_M._Tscharntke.pdf Download (3MB)

Abstract

Eine funktionierende Wundheilung ist die Voraussetzung für eine normale Funktion der Haut. In Drosophila melanogaster wird die kleine GTPase Rac1 für den dorsalen Schluß während der Embryogenese benötigt. Dies ist ein Prozess, welcher der Wundheilung in Säugetieren sehr ähnelt. Es ist bekannt, dass Rac1 ein Regulator für wichtige Funktionen des Zytoskelettes ist und somit Einfluss auf Zelladhäsion, -migration, -proliferation und -transformation besitzt. In muriner Epidermis verursacht die induzierbare Deletion von Rac1 möglicherweise einen Verlust der epidermalen Stammzellen. Um die Funktionen von Rac1 in Keratinozyten der basalen epidermalen Schichten und in der äußeren epithelialen Wurzelscheide der Haarfollikel aufzuklären, wurden transgene Mäuse generiert, die entweder eine dominant negative Mutante von Rac1, N17Rac1 oder eine konstitutiv aktive Mutante L61Rac1 unter der Kontrolle des Keratin 14 Promotors exprimierten. Bei diesen Mäusen konnte für beide Konstrukte kein spontaner Phänotyp beobachtet werden. Die N17Rac1 transgenen Mäuse zeigten jedoch in Wundheilungsexperimenten eine verzögerte Reepithelialisierung. Untersuchungen der hier zu Grunde liegenden Mechanismen offenbarten, dass in vivo die Proliferation von Keratinozyten am Wundrand und die zentripetale Migration der neugebildeten Epidermis beeinträchtigt sind. Ähnliche Ergebnisse wurden mit Mäusen mit einer epidermisspezifischen Deletion von Rac1 produziert. Primäre epidermale Keratinozyten, die N17Rac1 exprimierten, proliferierten weniger als Kontrollzellen und zeigten eine reduzierte Adhäsion und Ausbreitung auf Kollagen Typ I aber nicht auf Fibronektin. Ebenso zeigten die Untersuchungen einzelner N17Rac1 transgener Keratinozyten, dass diese auf Kollagen Typ I und nicht auf Fibronektin bei der willkürlichen Migration und der Fähigkeit, artifizielle Wunden zu schließen, stärkere Beeinträchtigungen im Vergleich zu Kontrollzellen aufwiesen. Erste Hinweise lassen vermuten, dass die Bildung fokaler Kontakte in primären murinen Keratinozyten bei der Inhibition von Rac1 gestört ist. Um einen Einblick in eine mögliche Rolle von Rac1 bei der Tumorbildung zu bekommen, wurden die beiden Rac1 Mutanten jeweils in verschiedene epidermale Tumor-Mausmodelle eingekreuzt. Die Kreuzung der N17Rac1 transgenen Mäuse mit transgenen Mäusen, die epidermal HPV8 exprimierten, zeigten nach Behandlung mit UVA/UVB- Strahlen eine deutliche Reduktion in der Entwicklung von HPV8 induzierten Papillomen. Die Kreuzung von RacL61 transgenen Mäusen mit der deltaNlef transgenen Maus zeigte bei den doppelt transgenen Tieren nach Behandlung mit dem Mutagen DMBA eine Entdifferenzierung der entstehenden Tumore. Wir schließen aus den Ergebnissen, dass Rac1 für die normale epidermale Wundheilung benötigt wird und in diesem Zusammenhang die Proliferation und die Migration der Keratinozyten regulieren kann. Unsere Ergebnisse lassen weiterhin die Vermutung zu, dass Rac1 die Rolle eines Onkogens bei der Entstehung epidermaler Tumore spielen kann.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Efficient epidermal wound repair is a prerequisite for normal skin Funktion. In Drosophila melanogaster the small GTPase Rac1 is known to be required for dorsal closure, a process that resembles epidermal wound healing in mammals. Rac1 has been known as a regulator of cytoskeletal functions that determine cell adhesion, migration and proliferation and transformation. In murine epidermis, inducible deletion of Rac1 results in depletion of the epidermal stem cell pool. In order to address functions of Rac1 in keratinocytes of the basal epidermal layer and in the outer root sheath of hair follicles, we generated transgenic mice expressing a dominant inhibitory mutant of Rac, N17Rac1 and a constitutively active mutant, L61Rac1, under the control of the keratin 14 promoter. These mice do not exhibit an overt skin phenotype but the N17Rac1 transgenic mice show protracted skin wound re- epithelialization. Investigation into the underlying mechanisms of N17Rac1 transgenic mice revealed that in vivo both proliferation of wound edge keratinocytes and centripetal migration of the neo- epidermis were impaired. Similar results were obtained in mice with epidermis specific deletion of Rac1. Primary epidermal keratinocytes that expressed the N17Rac1 transgene were less proliferative than control cells and showed reduced adhesion and spreading on collagen I but not on fibronectin. Likewise, random migration of single N17Rac1 transgenic keratinocytes and closure of scratch wounds in N17Rac1 expressing keratinocyte monolayers showed a greater impairment on collagen I than on fibronectin in comparison to the respective controls. The function of vinculin containing focal adhesion complexes was impaired in N17Rac1 transgenic keratinocytes. To gain further insight into the role of Rac1 in skin tumor development we crossed the Rac1 mutants to mouse models of epidermal tumorogenesis. Crossbreeding of N17Rac1 transgenic mice with HPV8 expressing transgenic mice showed a reduction in tumor growth after UVB/UVA light treatment compared to HPV8 transgenic control mice. Additionally, crossbreeding of the L61Rac1 transgenic mice with transgenic mice for deltaNlef showed less tumor growth but impaired tumor differentiation in the presence of L61Rac1. We conclude that Rac1 is functionally required for normal epidermal wound healing and in this context exerts a dual function, namely the regulation of keratinocyte proliferation and migration. Rac1 also seems to play a role in the regulation of epidermal tumor development in vivo. English
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Tscharntke, Michael tscharntke.michael@email.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-18946
Date:	2006
Language:	German
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Chemistry > Institute of Biochemistry
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Haut , Rac1 , kleine GTPase , Wundheilung German Skin , Rac1 , small GTPase , wound healing English
Date of oral exam:	4 July 2006
Referee:	Name Academic Title Klein, Helmut Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/1894