Universität zu Köln

Bollig, Klaus (2006). Hydroxyprolin gebundene Glykane der Zellwand von Chlamydomonas reinhardtii. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Die Superfamilie der extrazellulären Hydroxyprolinreichen Glykoproteine (HRGPs) ist ein im Pflanzenreich nahezu ubiquitärer Bestandteil der extrazellulären Matrix von Pflanzen. HRGPs besitzen in ihrer Primärsequenz Hydroxyprolin-reiche Motive, die posttranslational modifi-ziert werden und O-glykosidisch an Hydroxyprolin gebundene Zuckerseitenketten tragen. Die Funktionen der HRGPs sind vielfältig. Die Proteine verstärken die Zellwand geben ihr aber gleichzeitig auch die nötige Flexibilität. Daneben besitzen Hydroxyprolinreiche Glyko-proteine wichtige Funktionen bei der Pathogenabwehr, bei Wundheilungsprozessen und bei Zell-Zell-Interaktionen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden die Hydroxyprolin gebundenen Glykane aus Arabidopsis thaliana und Chlamydomonas reinhardtii gereinigt und strukturell untersucht. Zur vollständigen Bestimmung der Struktur von kurzen linearen Hydroxyprolin gebundenen Glykane wurden Reinfraktionen durch Ionenaustauschchromatographie und HPLC gewonnen. Diese wurden massenspektrometrisch, gaschromatographisch, durch Methylierungsanalyse und magnetische Kernresonanzspektroskopie bestimmt. Die Analysen der Hydroxyprolin gebundenen Glykane von Arabidopsis thaliana bestätigen zunächst den aus Karotte oder Tabak bekannten Aufbau der Verbindungen HypAra3 und HypAra4 und unterstützen damit die Theorie, dass die Extensine aller höheren Landpflanzen die gleichen Glykosylierungsmuster aufweisen. Die über HPLC gereinigten Glykane der Grünalge C. reinhardtii tragen die für höhere Pflanzen beschriebenen zwei ß-L-1,2 verbundenen Arabinofuranosen als erste Baueinheiten. Die Kettenverlängerung zum Hyp-triglykan erfolgt durch Anhängen einer ß-D-Galakto-furanose, die zudem auch an C6 methyliert sein kann. In den gereinigten Hyp-tetrasacchariden wurde eine weitere α-L-Arabinofuranose terminal bestimmt, die ebenfalls an C3 methyliert vorliegen kann. Das gemeinsame innere Grundelement der zwei ß-L-1,2 verbundenen Arabinofuranosen in Hyp-Glykanen der Alge und höherer Pflanzen lässt auf einen gemeinsamen evolutiven Ursprung rückschließen. Das weitere Augenmerk der Arbeit galt der wesentlich höheren Komplexität der C. reinhardtii Glykane und wurde vorwiegend an durch Kationenaustauschchromatographie angereicherten Präparationen durchgeführt, die massenspektrometrisch, gaschromatogra-phisch und durch Methylierungsanalysen charakterisiert wurden. Dabei wurden für die Hyp-Glykane bis zu einer Größe von vier gebundenen Zuckern aus C. reinhardtii folgende Gesetzmäßigkeiten gefunden: 1. Die HypGlykane aus Chlamydomonas tragen ebenso wie die Extensine höherer Pflanzen zwei an Hydroxyprolin gebundene ß-L-1,2 verbundene Arabinofuranosen. 2. Diese Grundeinheit wird bei allen Chlamydomonas Glykanen immer durch ein Galaktosemonomer verlängert, das vorwiegend in Furanoseform vorliegt. 3. Die Verlängerung zu den Hyp-tetrasachchariden kann über Arabinose, Galaktose oder Glukose erfolgen. 4. Methylierungen erfolgen spezifisch und ausschließlich an einem Zucker, der entweder in Position C oder D des Hyp-Glykans zu finden ist. Hierbei handelt es sich wahrscheinlich um ein Charakteristikum der ganzen Gattung, denn auch die Untersuchung einer weiteren Chlamydomonas Art, von Chlamydomonas incerta, bestätigen diese Befunde. Weiterhin erlauben die gewonnenen Ergebnisse den Rückschluss auf die wesentlichen Schritte der Biosynthese der Verbindungen und auf die an der Synthese beteiligten, noch unbekannten Glykosyltransferasen. Untersuchungen zur Abhängigkeit der Glykosylierung vom Zellzyklus zeigen schließlich einen Umbau der Hydroxyprolin gebundenen Glykane während der vegetativen Fortpflanzung der Grünalge. Die Methylierungsanalysen lassen hierbei vermuten, dass an dieser Umstruk-turierung die 1,2 verbundenen Arabinosemonomere der HypGlykane beteiligt sind.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language Hydroxyproline bound Glycans from the cell wall of Chlamydomonas reinhardtii English
Translated abstract:	Abstract Language Members of the superfamily of hydroxyproline-rich glycoproteins (HRGPs) can be found in the extracellular matrix throughout the plant kingdom. HRGPs show characteristic hydroxyproline-rich, repetitive motifs, which are posttranslationally modified by o-linked glycans bound to hyp. Functions of HRGPs are multifarious. They strengthen the wall, but provide additional flexibility at the same time. Furthermore, HRGP have important functions during pathogen defence, wound healing and cell-cell-interaction. During this study, hydroxyproline bound glycans from Arabidopsis thaliana and Chlamydomonas reinhardtii werde purified und structurally characterized. For a detailed structural analysis, short linear hyp glycans were purified to homogeneity by cation exchange chromatography and HPLC. The respective isolated compounds were analysed by mass spectrometry (ESI-MS), gaschromatography, methylation analysis (GC-MS) and nuclear magnetic resonance. The data obtained for hyp glycans isolated from Arabidopsis thaliana corroborate the structures for HypAra3 and HypAra4 determined for carrot and tobacco und support the general idea, that hyp-glycans from higher plants have a conserved glycosylation pattern. The HPLC-purified hyp-glycans isolated from C. reinhardtii were shown to contain the same two ß-L-1-2 linked arabinoses as inner core like those observed in the higher plant hyp glycans. The hyp-bound trisaccharide is formed by addition of a ß-D-galactose, which can be methylated on C6-position. The purified hyp-tetrasaccharides contained another terminal α-L-arabino-furanose, which can be methylated at C3-position. The existence of the common inner core element of two ß-L-1,2-linked arabinofuranoses suggests one evolutionary offspring. The second interest of this study was directed towards understanding the complexity of hyp-glycosylation in C. reinhardtii. The analysis was performed using enriched hyp-glycan fractions obtained by cation-exchange-chromatography which were analysed by mass spectrometry, gaschromatography and methylation analysis. According to the data obtained following rules for hyp-glycans (with up to four bound sugars) in C. reinhardtii seem to emerge: 1. There are always two ß-L-1,2 arabinosefuranoses linked to hydroxyproline. 2. Galactose, predominantly in its unusual furanose-form, is always linked to the inner core described in 1. 3. The hyp-ara2-gal trisaccharide is substrate for another arabinosyltransferase, a glucosyl- or galactosyltransferase. 4. methylation of sugars is specific; there is never more than one sugar species with a position in C or D methylated. This rules seem to be characteristic for the genus Chlamydomonas in general, as the analysis of C. incerta hyp-glycans supported the findings obtained for C. reinhardtii hyp-glycans. Furthermore, the data obtained allow important conclusion towards the biosynthetic pathway of hyp-glycans in Chlamydomonas as well as enzymes involved, none of which are known so far. Prelimary analysis of glycosylation patterns suggest a rearrangement of hyp-glycans during the cell cycle. The data of the methylation analysis suggest that the ß-1-2-linked arabinoses might be crucially involved in that process. English
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Bollig, Klaus acc30@uni-koeln.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-19121
Date:	2006
Language:	German
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Chemistry > Institute of Biochemistry
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Hydroxyprolin, Glykan, Chlamydomonas, reinhardtii German
Date of oral exam:	5 December 2006
Referee:	Name Academic Title Waffenschmidt, S. Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/1912