Universität zu Köln

Zielke, Norman (2007). Functional analysis of the cell cycle regulator Rca1 in Drosophila melanogaster. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Tight regulation of APC/C activity is essential for cell cycle progression. An important class of negative APC/C regulators are the Rca1/Emi1 family proteins. All members of the Rca1/Emi1 family share a conserved zinc binding region (ZBR) which is essential for their inhibitory activity. The Rca1/Emi1 proteins belong to the class of F-box proteins that are known to act as substrate recognition subunits in SCF-E3-ligase complexes. Emi1 and Rca1 interact in vitro with members of the Skp family via the F-box. However, no F-box dependent function has been ascribed to these proteins. In Drosophila, Rca1 is required in G2 to prevent premature activation of the APC/C by Fzr. Loss of Rca1 results in an arrest during G2 of the 16th embryonic cell cycle due to premature cyclin degradation. In order to map the essential domains for Rca1 function, a series of deletion constructs was tested for their ability to inhibit APC/C-Fzr activity in vivo. A C-terminal Rca1 fragment including the ZBR was sufficient to restore mitosis 16 in rca1 mutant embryos. This observation confirms that the ZBR is the only protein motif essential for APC/C-Fzr inhibition by Emi1/Rca1. Moreover, this result indicates that the F-box is dispensable for APC/C-Fzr inhibition during embryogenesis. However, analysis of Rca1 function during larval development revealed that Rca1 has a secondary role as an F-box protein. Using the MARCM technique, wing disc cells were generated in which endogenous Rca1 was replaced by an Rca1 construct lacking the F-box. These cells displayed a reduced proliferation rate and prolonged G1-phase. Conversely, overexpression of Rca1 accelerates the G1-S transition in imaginal discs in an F-box dependent manner. Hence, it is likely that Rca1 regulates S-phase entry as part of a yet uncharacterized SCF-complex. In addition, the effect of Rca1 on endoreplication was analyzed. Overexpression of Rca1 during salivary gland development leads to a reduction of polyploidization. This phenotype also depends on a functional F-box. Endoreplication cycles are driven by oscillating waves of Cyclin E/Cdk2 activity, whereas Cdk1 and the mitotic cyclins are transcriptionally downregulated. Furthermore, APC/C-Fzr activity seems not to be required once the endoreplication program has been initiated. Cells overexpressing Rca1 displayed elevated levels of Cyclin E, although Cyclin E is not a target of the APC/C-Fzr complex. It has been shown that continuous expression of Cyclin E interferes with DNA-licensing. Thus, the reduced DNA content in Rca1 overexpressing cells might be due to elevated Cyclin E levels. Additionally, Rca1 overexpressing cells displayed markers for mitotic cells such as Cdk1 and nuclear Cyclin A. The accumulation of Cdk1, Cyclin A and Cyclin E cannot simply be explained by APC/C inhibition. It rather appears that Rca1 activates the transcription of these genes by an unknown mechanism. Nevertheless it cannot be excluded that the APC/C-Fzr complex indirectly contributes to this process. Altogether, Rca1 might act as an F-box protein in an SCF complex that is involved in maintaining diploidy.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language Funktionale Analyse des Zellzyklus Regulators Rca1 in Drosophila melanogaster German
Translated abstract:	Abstract Language Für den korrekten Verlauf der Mitose ist ein strikte Kontrolle des APC/C notwendig. Eine wichtige Klasse von negativen APC/C Regulatoren sind die Proteine der Rca1/Emi1 Familie. Alle Mitglieder der Rca1/Emi1 Familie besitzen eine konservierte zink-bindende Region, welche für ihre Aktivität essentiell ist. Die Rca1/Emi1 Familie gehört zur Gruppe der F-Box Proteine, die als Substrat-Erkennungs Module der SCF-E3-Ligase fungieren. Emi1 und Rca1 binden in vitro mit Hilfe ihrer F-Box an Mitglieder der Skp Familie. Bisher wurde jedoch kein Kontext gefunden, in dem die F-Box benötigt wird. In der G2-Phase von Zellzyklus 16 von Drosophila, verhindert Rca1 die frühzeitige Aktivierung des APC/C-Fzr Komplex. Der Verlust des rca1 Gens führt zu einem Arrest in der G2-Phase von Zellzyklus 16 und einem vorzeitigen Abbau der mitotischen Cycline. Rca1 enthält mehrere konservierte Proteinmotive deren Funktion mit Hilfe einer Deletionsanalyse aufgeklärt werden sollte. Diese Analyse zeigte, dass ein C-terminales Rca1 Fragment für die Rettung des Phänotyps von rca1 Mutanten ausreichend ist. Diese Beobachtung bestätigt, dass die ZBR das einzige essentielle Proteinmotiv für die Inhibition des APC/C durch Mitglieder der Rca1/Emi1 familie ist. Außerdem wird deutlich, dass während der Embryogenese die F-Box nicht für die Inhibition des APC/C benötig wird. Weiterführende Untersuchungen zeigten jedoch, dass Rca1 eine zusätzliche Funktion hat und dass für diese die F-Box benötigt wird. Durch Verwendung der MARCM Technik konnte in Flügel-Imaginalscheibenzellen das endogene Rca1 Protein durch ein Konstrukt ohne F-Box ersetzt werden. Diese Zellen haben eine reduzierte Teilungsaktivität und benötigten länger für das Durchschreiten der G1-Phase. Umgekehrt führte die Überexpression von Rca1 zu einem vorzeitigen Eintritt in die S-Phase. Daher ist es wahrscheinlich das Rca1 Teil eines SCF-Komplexes ist, der den Übergang in die S-Phase reguliert. Zusäztlich dazu wurde der Effekt von Rca1 auf Endoreplikationszyklen untersucht. Die Überexpression von Rca1 im Verlauf der Speicheldrüsenentwicklung führte die zu einer verringerten Polyploidität, wobei dieser Phänotyp ebenfalls eine funktionale F-Box benötigt. Oszillierende Cyclin E/Cdk2 Aktivität ist essentiell für den korrekten Ablauf von Endoreplikationszyklen. In Endoreplikationszyklen wird außerdem die Transkription von Cdk1 und der mitotischen Cyclin abgeschaltet. Weiterhin wurde postuliert dass die Aktivität des APC/C-Fzr Komplex nicht mehr erforderlich ist, sobald das Endoreplikations-Programm initiert wurde. Obwohl Cyclin E kein Substrat des APC/C-Fzr Komplex ist, zeigten Rca1 überexprimierende Zellen erhöhte Mengen an Cyclin E. Es konnte in früheren Experimenten gezeigt werden, dass die kontinuierliche Expression von Cyclin E mit der Initiation der DNA Replikation interferiert. Daher ist der reduzierte DNA-Gehalt in Rca1 überexprimierenden Zellen wahrscheinlich auf die erhöhte Menge an Cyclin E zurückzuführen. Die Rca1 überexprimierenden Zellen zeigten außerdem Indikatoren für mitotische Zellen, wie Cdk1 und nukleares Cyclin A. Die Akkumulation von Cyclin E, Cyclin A und Cdk1 kann nicht durch Inhibition des APC/C-Fzr Komplexes erklärt werden. Rca1 scheint vielmehr die Transkription dieser Gene zu aktivieren, wobei jedoch nicht ausgeschlossen werden kann, dass der APC/C-Fzr Komplex indirekt an diesem Vorgang beteiligt ist. Zusammengefasst deuten diese Resultate daraufhin, dass Rca1 Teil eines SCF-Komplexes ist, der für die Aufrechterhaltung des diploiden Zustands notwendig ist. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Zielke, Norman rcaone@gmail.com UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-19409
Date:	2007
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Biology > Institute for Genetics
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Zellzyklus Drosophila German Cell cycle Drosophila English
Date of oral exam:	9 January 2007
Referee:	Name Academic Title Sprenger, Frank PD Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/1940