Universität zu Köln

Spitzer, Christoph (2007). The Arabidopsis elch mutant reveals functions of an ESCRT component in cytokinesis. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

The Endosomal Sorting Complex Required for Transport (ESCRT) regulates important functions in the secretory system of yeast and animals. The main responsibilities that have been described so far are sorting of biosynthetic cargo and receptor-downregulation. The scope of my PhD thesis was the analysis of the Arabidopsis ELCH protein that is similar to Vps23p and TSG101. These proteins represent the core components of ESCRT I complex in yeast and animals. I could show that ubiquitin binding and complex formation is conserved between Arabidopsis, yeast and animals, supporting the idea that ESCRT mediated protein sorting is a general strategy in eukaryotic organisms. New ELCH/ESCRT-I interacting proteins were isolated by immunoprecipitation and subsequent mass spectrometry. By this approach a plant specific protein containing a UBiquitin Associated (UBA) domain and several subunits of the vacuolar (H+)-ATPase were identified. The VHA-a3 subunit of the vacuolar (H+)-ATPase was analysed in more detail for ubiquitin modifications because mono-ubiquitination constitutes the sorting signal for the ESCRT pathway. Two colour western analysis showed that VHA-a3 is mono-ubiquitinated indicating that VHA-a3 might be a target of ELCH/ESCRT-I. Similar to the ESCRT pathway the V-ATPase is involved in the sorting of biosynthetic cargo and receptor-downregulation in yeast. No interaction between the ESCRT pathway and the V-ATPase has been reported so far. A T-DNA mutation in the ELCH gene of Arabidopsis results in multiple nuclei in a minority of epidermal cells. As multinucleated cells can be an indication for a cell division defect, trichomes, pavement cells and stomata were examined in respect to incomplete cell walls. Cell wall stubs were observed in pavement cells and stomata but not in trichomes. Similar defects have not been observed in yeast vps23 but the multinucleated phenotype of elch resembles the phenotype observed in TSG101 mutant cell lines. Furthermore cytokinesis defects are reported in Arabidopsis mutants lacking the VHA-E subunit of the V-ATPase. Plants mutant for VHA-E are embryonic lethal and display incomplete cell walls, multiple nuclei and aberrant vacuoles (Strompen et al., 2005). Although mutations in ELCH, TSG101 and VHA-E cause a similar phenotype only vague ideas exist why compromising the ESCRT pathway or the V-ATPase lead to cell division defects. A cue was provided by genetic analysis, which suggests that ELCH influences cell division by regulating microtubules. This is apparent because a double mutant with tubulin-folding cofactor a (tfc-a) shows a strong synergistic phenotype. Cell wall development during plant cell division depends heavily on a plant specific structure, the phragmoplast. The secretory system and microtubules are the main components of the phragmoplast. Therefore it seems reasonable to assume that subtle protein sorting defects, mislocalization of membranes or misregulation of microtubules can lead to the observed cell division defect.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language Die Arabidopsis elch Mutante enthüllt Funktionen einer ESCRT Komponente während der Zytokinese German
Translated abstract:	Abstract Language Innerhalb des Sekretorischen Systems von Hefen und Tieren reguliert der Endosomal Sorting Complex Required for Transport (ESCRT) wichtige Aufgaben. Dazu gehört die Sortierung von Biosynthese-Produkten und die Regulation von Plasma Membran Rezeptoren. Das Ziel meiner Doktorarbeit war die Untersuchung des ELCH Proteins aus Arabidopsis welches Ähnlichkeit zu Vps23p und TSG101 aufweisst. Diese Proteine bilden die Kernkomponenten des ESCRT-I Komplexes in Hefen und Tieren. Ich konnte zeigen, dass die Ubiquitinbindung und Komplexbildung zwischen Arabidopsis, Hefen und Tieren konserviert ist. Dies stützt die These, dass die ESCRT vermittelte Proteinsortierung eine allgemeine Strategie eukaryontischer Organismen ist. Mit ELCH bzw. ESCRT-I interagierende Proteine wurden durch Immunoprecipitation und anschliessender Massenspektrometrie identifiziert. Mit dieser Vorgehensweise wurde ein Protein mit UBiquitin-Assoziierter Domäne, sowie mehrere Untereinheiten der vakuolären ATPase isoliert. Die VHA-a3 Untereinheit der vakuolären ATPase wurde genauer auf eine mögliche Modifizierung mit Ubiquitin untersucht da Mono-Ubiquitinierung das Erkennungssignal des ESCRT Proteinsortierungsweges ist. Mittels Infrarot Fluoreszenz konnte gezeigt werden das VHA-a3 mono-ubiquitiniert wird was darauf hindeutet das dieses Protein von den ESCRT Komplexen sortiert wird. Die vakuoläre ATPase ist, ähnlich wie die ESCRT Komplexe, an der Sortierung von Biosynthese-Produkten und der Regulation von Plasma Membran Rezeptoren beteiligt. Eine Interaktion zwischen einem ESCRT Komplex und der V-ATPase konnte bisher nicht gezeigt werden. Eine T-DNA Insertion im ELCH Gen von Arabidopsis führt dazu, dass eine geringe Anzahl von Zellen mehr als einen Zellkern aufweisen. Da mehrkernige Zellen auf Zellteilungsdefekte hinweisen, wurden Trichome, Blattepidermiszellen und Stomata auf unvollständige Zellwände untersucht. Diese konnten in Stomata und Blattepidermiszellen nachgewiesen werden, nicht aber in Trichomen. Zellteilungsdefekte wurden bisher nicht in vps23 Mutanten beobachtet, sie erinnern jedoch an mehrkernige Zellen welche in TSG101 mutanten Zelllinien vorhanden sind. Ferner sind Arabidopsis Linien, die Mutationen in der Untereinheit E der vakuolären ATPase aufweisen, embryonal lethal. Sie zeigen Zellteilungsdefekte, sowie eine gestörte Vakuolen Morphologie (Strompen et al., 2005). Obwohl Mutationen in ELCH, TSG101 und VHA-E ähnliche Phänotypen hervorrufen, konnte bisher nicht ermittelt werden warum Störungen des ESCRT Systems oder der vakuolären ATPase zu Zellteilungsdefekten führen. Genetische Analysen mit der tubulin-folding cofactor A (tfc-a) Mutante legen nahe, dass ELCH die Zellteilung durch Regulation von Mikrotubuli beeinflusst. Zellteilung in Pflanzen ist im hohen Maße von einer pflanzenspezifischen Struktur, dem Phragmoplast abhängig. Dessen Hauptbestandteile sind Mikrotubuli und Vesikel. Störungen im Zusammenspiel dieser Komponenten können mit hoher Wahrscheinlichkeit zu den beobachteten Zellteilungsdefekte führen. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Spitzer, Christoph christoph.spitzer@gmail.com UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-19431
Date:	2007
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Biology > Botanical Institute
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Endosome ,Vacuole ,ESCRT ,MVB ,Arabidopsis English
Date of oral exam:	9 January 2007
Referee:	Name Academic Title Hülskamp, Martin Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/1943