Universität zu Köln

Becker, Alexander (2006). Intra- und extrazelluläre Mechanismen bei der Pathogenese von Chondrodysplasien. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Die Pseudoachondroplasie (PSACH) und die Multiple Epiphysäre Dysplasie (MED) sind zwei konstitutionelle Skeletterkrankungen, die zu disproportioniertem Minderwuchs führen, wobei MED mildere Symptome aufweist als PSACH. Beide Formen werden u.a. durch Mutationen im Gen für das cartilage oligomeric matrix protein (COMP) hervorgerufen, die häufig zur Rentention des Proteins im endoplasmatischen Retikulum (ER) führen. Die physiologische Funktion von COMP und dessen Rolle bei der Pathogenese ist jedoch weitgehend unbekannt. In der vorliegenden Arbeit wurden die Auswirkungen mehrerer Mutationen (D361Y, D469, D475N, H587R) zunächst im bovinen und murinen Zellkulturmodellen untersucht. Primäre Chondrocyten wurden mit myc-markierten Wildtyp bzw. mutierten COMP-Konstrukten sowohl transfiziert als auch transduziert und in monolayer- und Alginatkulturen analysiert. Es stellte sich heraus, dass die Pathogenese vielfältiger ist als bisher angenommen, sodass PSACH und MED nicht nur als ER-Speicherkrankheit gelten können, sondern auch extrazelluläre Mechanismen eine Rolle spielen. Während es bei allen untersuchten Aspartat- Mutationen zu Sekretionsstörungen und einer Erweiterung des ER kommt, wird H587R COMP ungehindert sekretiert. Trotz der Verzögerung erreichen auch alle Aspartat-Mutanten letztendlich zu einem gewissen Teil die extrazelluläre Matrix. Chondrocyten, die PSACHassoziierte COMP-Varianten (D469, D475N, H587R) exprimieren, fehlt eine Matrix mit organisierten Collagen-Fibrillen. Stattdessen entstehen amorphe Aggregate. Die MEDassoziierte Mutation (D361Y) bewirkt, wie auch in ihrem Sekretionsverhalten, weniger drastische Veränderungen. Dies impliziert einen Zusammenhang zwischen zellulärem Phänotyp und Ausprägung der Krankheit. Die Induktion der Apoptose ist ungeachtet des Sekretionsverhaltens und des Phänotyps der extrazellulären Matrix bei allen Mutanten erhöht. Die Zellen weisen charakteristische intrazelluläre Veränderungen der Apoptose auf. Subtile Strukturänderungen von rekombinant exprimierten COMP-Varianten manifestieren sich in Abhängigkeit der Calciumkonzentration bzw. nach Entzug von Calcium. Diese Veränderungen wirken eindeutig auf die Funktion von COMP als Chaperon der Collagen- Fibrillogenese, obwohl die apparente Affinität sich nur unwesentlich unterscheidet. Während bei Aspartat-Mutationen die Fibrillogenese von Collagen I und II/XI im Vergleich zum Wildtyp Protein verzögert ist, scheint sie mit H587R COMP beschleunigt. Allerdings sind die durch Inkubation mit H587R COMP entstehenden Fibrillen erheblich in ihrer Struktur gestört, was im Einklang mit den beobachteten Aggregaten im Zellkulturmodell steht. Dass extrazelluläres mutiertes COMP auch zurück auf die Zellen wirken kann, wurde in Zelladhäsionsversuchen nachgewiesen. Entgegen der vorherrschenden Ansicht, wirken bei der Pathogenese von PSACH und MED sowohl intra- als auch extrazelluläre Mechanismen. Diese tragen zum erhöhten Zelltod und der Desintegration des Knorpelgewebes bei, die möglicherweise den Minderwuchs bedingen.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language Intra- and extracellular mechanisms of the pathogenesis of chondrodysplasias English
Translated abstract:	Abstract Language Pseudoachondroplasia (PSACH) and multiple epiphyseal dysplasia (MED) are two constitutional skeletal diseases, which lead to disproportionate dwarfism. MED is the clinically milder disease. Both forms are mostly associated with mutations in the gene for the cartilage oligomeric matrix protein (COMP). These mutations often lead to intracellular retention of the protein in the endoplasmic reticulum (ER). The physiological function of COMP and its role in the pathogenesis of chondrodysplasias is largely unknown. In the present study the effects of a panel of disease-causing mutations (D361Y, D469, D475N, H587R) were examined, initially in bovine and murine cell culture systems. Primary chondrocytes were transfected or transduced with myc-tagged wildtype or mutated COMP constructs and examined in monolayer or three dimensional alginate culture. It was found that the pathogenesis is more diverse than previously thought. PSACH and MED are not exclusively storage diseases, but extracellular mechanisms also play a role in pathogenesis. While all analyzed aspartate mutations showed a disturbed secretion and caused an enlarged ER, the secretion of H587R COMP was unaffected. Despite the retention all aspartate mutant proteins reach eventually the extracellular matrix. Chondrocytes expressing PSACH-associated COMP variants (D469, D475N, H587R) lack well defined distinct collagen fibrils in the extracellular matrix. Instead amorphous aggregates are formed. The MED-associated mutation (D361Y) gave a mild retention and limited matrix alterations. This implies a connection between the cellular phenotype and disease characteristics. Apoptosis was elevated by all mutant proteins irrespective of the secretion behaviour and extracellular matrix phenotype. On ultrastructural level the chondrocytes showed intracellular characteristic channges of apoptosis. For analysis on molecular level the COMP variants were expressed recombinantly. Subtle structural alterations were revealed in dependence of calcium concentration. These changes affect the function of COMP as a chaperone in collagen fibrillogenesis, although the apparent affinity is only moderately altered. While the fibrillogenesis of collagen I and II/XI is delayed due to aspartate mutations, it is accelerated by H587R COMP. However fibrils formed in the presence of H587R COMP display a disrupted structur. This is consistent with the matrix alterations observed in the cell culture model. In cell adhesion assay it was found that extracellular mutant COMP influence cell behaviour. In contrast to the predominant opinion, the pathogenesis of PSACH and MED includes extracellular as well as intracellular mechanisms. Both pathways contribute to an increased cell death and a disintegration of the cartilage matrix which may cause the dwarfism. English
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Becker, Alexander alexander.becker@uni-koeln.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-19630
Date:	2006
Language:	German
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Medicine > Biochemie > Institut II für Biochemie
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Pseudoachondroplasie , Multiple Epiphysäre Dysplasie , COMP German pseudoachondroplasia , multiple epiphyseal dysplasia , COMP English
Date of oral exam:	11 January 2007
Referee:	Name Academic Title Paulsson, Mats Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/1963