Universität zu Köln

Jaekel, Robert (2006). Regulation des Notch-Signalweges durch Lethal (2) giant discs (Lgd) und durch die Notch-Liganden. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Der Notch-Signalweg wird zur direkten Kommunikation benachbarter Zellen als eine Art binärer Schalter eingesetzt, über dessen Aktivität eine Vielzahl unterschiedlicher Prozesse in der Entwicklung und Homöostase von Tieren und Menschen beeinflußt wird. Der Ausfall von Kernkomponenten des Notch-Signalweges während der Entwicklung ist in den meisten Fällen letal, eine Überaktivierung während des Lebenszyklus ist im Menschen unter anderem mit der Entstehung von Leukämie und Darmkrebs in Zusammenhang gebracht worden. Zwei Mechanismen, die zur Regulation der Aktivität des Notch-Signalweges in Drosophila melanogaster eingesetzt werden, sind innerhalb dieser Arbeit untersucht worden. Dies war zum einen das Gen lethal (2) discs (lgd), welches in vorangegangenen Experimenten als notwendig für die Regulation der Notch-Aktivität während der Flügelentwicklung gezeigt, und im Rahmen dieser Arbeit kloniert und molekularbiologisch charakterisiert wurde. Lgd, das in allen Metazoen vorkommt, gehört zu einer neuen Proteinfamilie und weist eine vierfache Wiederholung der neuartigen DM14-Domäne und eine C2-Domäne am C-Terminus auf. Die C2-Domäne konnte als verantwortlich für die subzelluläre Lokalisation von Lgd gezeigt werden, während die Funktion der DM14-Domäne unklar bleibt. Eine Deletionsanalyse legte aber nahe, daß sie möglicherweise eine unterstützende Funktion hat. Lgd ist zytoplasmatisch lokalisiert und in dem endosomalen Transport von Notch und weiteren Proteinen involviert. Bei einem Ausfall der lgd-Funktion wie bei einer Lgd-Überexpression kommt es zur Entstehung großer Endosomen, die den Notch-Rezeptor und andere Proteine enthalten und von einer ektopischen Aktivierung des Notch-Signalweges begleitet sind. Expression von murinen Lgd-Orthologen konnte die mutante Situation in der Flügelimaginalscheibe retten, was nahelegt, daß Lgd möglicherweise auch in den Vertebraten bei der Regulation der Notch-Aktivität eine Rolle spielen könnte. Das zweite Projekt setzte sich mit der ligandenabhängigen cis-Inhibierung des Notch-Rezeptors auseinander. Hohe Konzentrationen von Liganden des Notch-Rezeptors verhindern die Aktivierung des Rezeptors auf der gleichen Zelle. Weder der dieser Inhibition zugrunde liegende Mechanismus, noch die dafür verantwortlichen Proteindomänen der Liganden konnten bisher identifiziert werden. Als ein Ansatz, die verantwortlichen Proteindomänen zu identifizieren, wurden Orthologe der Notch-Liganden aus den Vertebraten in die Fliege eingeführt, um zu überprüfen, ob mit der zahlenmäßigen auch möglicherweise eine funktionelle Diversifizierung der Liganden gegenüber dem Rezeptor einhergeht. Bei Expression in Flügelimaginalscheiben wurde die Interaktion der eingeführten Liganden anhand der Expression des Notch-Zielgenes wingless überprüft. Die Expression zweier der Liganden aus den Vertebraten, Delta-like-1 und -4 (DLL1 bzw. -4) aktivierte dabei die wg-Expression, zeigte jedoch keinen cis-inhibierenden Effekt auf, wie bei einer vergleichbaren Expression von Delta (Dl). Es wurden anschließend Hybridkonstrukte hergestellt, in denen zur ersten Eingrenzung der für die cis-Inhibition durch Dl verantwortlichen Domäne die extra- und intrazellulären Bereiche von DLL1 und DLL4 mit denen von Dl ausgetauscht wurden. Bei nachfolgender Expression der Hybride zeigte es sich, daß möglicherweise beide Domänen von Dl, sowohl die intra-, als auch die extrazelluläre, wenn auch in unterschiedlichen Maße, an der Vermittlung des cis-inhibitorischen Effektes beteiligt sind.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language Regulation of the Notch signalling pathway by Lethal (2) giant discs (Lgd) and the Notch ligands. English
Translated abstract:	Abstract Language The Notch signalling pathway is used as a binary switch in direct cell-cell communication, regulating different processes during the development and homeostasis of humans and higher eukaryotes. Loss of core components of the Notch signalling pathway during development is mostly lethal whereas hyperactivation of the Notch signalling pathway in later phases has been found to cause special forms of leukemia or colon cancer in humans. This thesis investigates various aspects of two mechanisms used for the regulation of the Notch signalling pathway activity in Drosophila melanogaster. The first part of this work describes the cloning and molecular characterization of the gene lethal (2) giant discs, which has been shown previously to be necessary for the regulation of Notch activity during the wing development in Drosophila. Lgd is a member of a new family of proteins, found in all metazoa. The Lgd protein shows four repeats of a novel DM14 domain followed by a C2 domain at the C-terminus. In this work the C2 domain has been shown to be responsible for the subcellular localization. The role of the DM14 domains remains unresolved, but the analysis of deletion constructs suggests an auxiliary function. Lgd is localized throughout the cytoplasm and is involved in the endosomal trafficking of Notch and other proteins. Loss of lgd function as well as Lgd overexpression causes the accumulation of large endosomes including the Notch receptor and other proteins, and leads to an ectopic activation of the Notch signalling pathway. Expression of the murine Lgd orthologs rescues loss of lgd function in the wing imaginal disc, suggesting a strong functional conservation and possibly an involvement of Lgd in the regulation of the Notch signalling pathway in mammals also. The second part of this work was on the ligand-dependent cis-inhibition of the Notch receptor. High concentrations of the ligands of the Notch receptor prevent the activation of the receptor in a cell-autonomous manner. Neither the mechanism underlying this inactivation, nor the protein domains responsible for this could be identified so far. In order to identify the responsible protein domains, vertebrate orthologs of the Drosophila Notch ligands were introduced into the fly to check whether the increased number of ligands in the vertebrates was also accompanied by a diversification of their function. The effects of the expression of the ligand orthologs and possible interactions with the endogenous Notch receptor were investigated by monitoring the expression of a target gene of the Notch activity, wg in the wing imaginal discs. Expression of two of the vertebrate ligands, Delta-like-1 and Delta-like-4 (DLL1 and DLL4) activated Wg expression in the experiments, though without the co-occurrence of the cis-inhibitory effect which can be observed during a comparable overexpression of Delta (Dl). To narrow down the Dl protein region responsible for the cis-inhibitory effect protein hybrids were constructed, exchanging the extra- and intracellular parts of DLL1 and DLL4 with their counterparts from Dl. The expression of the hybrid proteins showed a possible involvement of both, the extra- and the intracellular domain of Dl, in performing the cis-inhibitory effect, whereby the extracellular domain seemed to have a stronger impact on this English
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Jaekel, Robert r.jaekel@uni-koeln.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-19727
Date:	2006
Language:	German
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Biology > Institute for Genetics
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Lgd , Notch , Delta , Endozytose , Flügelentwicklung German Lgd , Notch , Delta , endocytosis , wing English
Date of oral exam:	5 November 2006
Referee:	Name Academic Title Klein, Thomas Priv.-Doz. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/1972