Universität zu Köln

Hochstein, Norbert (2006). Der epigenetische Status eines adenoviralen Transgenoms in Hamsterzellen. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Ein großer Teil des Genoms von Säugetieren besteht aus repetitiven Elementen und integrierter fremder DNA, wie z.B. viralen Retrotransposons. Eine natürlich vorkommende oder artifiziell herbeigeführte Integration fremder DNA in ein Wirtszellgenom kann die Transkription und den Methylierungszustand sowohl der fremden, als auch der zellulären DNA beeinflussen. Veränderungen von Methylierungsmustern spielen bei vielen biologischen Prozessen, wie z.B. bei der Embryonalentwicklung oder der Entstehung von Tumoren eine wichtige Rolle. In dieser Arbeit wurden der Methylierungszustand, die Transkription und die Nukleosomenorganisation sowie Histon-Modifikationen von integrierter Adenovirus-Typ-12-(Ad12)-DNA in den transformierten Zelllinien T637 und TR12 untersucht. Die Zelllinie T637 wurde durch Infektion von nicht-permissiven BHK21-Hamsterzellen mit Ad12 erzeugt. T637-Zellen haben etwa 15 Kopien des Ad12-Genoms an einer Stelle ihres Genoms aufgenommen. Bei fortlaufender Kultivierung konnten morphologische Revertanten isoliert werden, die unterschiedliche Mengen der ursprünglich integrierten adenoviralen DNA verloren haben. In dieser Studie konnte gezeigt werden, dass das Transgenom der revertanten TR12-Zelllinie aus einem vollständigen Ad12-Genom sowie einem 3,9 kbp langen rechten Ad12-Genom-Ende besteht und invertiert an das linke Ende der vollständigen Ad12-Kopie anschließt. In vorliegender Arbeit wurde der Methylierungszustand aller 1634 CpG-Dinukleotide im Ad12-Transgenom der Zelllinie TR12 mit Hilfe der Bisulfit-Methode untersucht. Über 85% der CpGs zeigen einen vollständig methylierten Status. Fast die Hälfte der 200 nicht- oder nur teilweise methylierten CpGs befinden sich an den Enden des Transgenoms, während sich die restlichen nicht-methylierten Stellen vereinzelt auf den sonst stark methylierten inneren Teil des Ad12-Transgenoms verteilten. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die adenoviralen Integrate in den Zelllinien T637 und TR12 in Nukleosomen organisiert sind. Eine wichtige Voraussetzung für die Integration von DNA ist eine offene Chromatin-Struktur an der Insertionsstelle, die in den Zelllinien T637 und TR12 ebenfalls belegt werden konnte. Da trimethylierte Histone H4 am Lysin 20 nur an den Enden der Ad12-Transgenome nachgewiesen werden konnten, ist eine Beteiligung dieser Histon-Modifikation an der Reparatur oder Erkennung von DNA-Doppelstrangbrüchen möglich. Des Weiteren konnte dokumentiert werden, dass die Transkription der integrierten adenoviralen Gene vom Methylierungszustand der jeweiligen Promotoren abhängt. Eine substantielle Transkription konnte nur in den nicht- oder hypomethylierten Promotorregionen der Gene E4 in T637- und TR12-Zellen sowie E1A und E1B in T637-Zellen nachgewiesen werden. Interessanterweise konnte in beiden Zelllinien eine geringe Transkription von Ad12-Genen mit hypermethylierten Promotoren, wie z.B. dem späten Hauptpromotor, beobachtet werden. Diese Arbeit beschreibt erstmals den kompletten und detaillierten Methylierungszustand eines integrierten adenoviralen Transgenoms und zeigt, dass Ad12-Transgenome der gleichen epigenetischen Regulation durch DNA- und Histon-Modifikationen unterliegen wie die Wirtszellgenome. Die hier gewonnenen Erkenntnisse tragen daher zu einem besseren Verständnis der de novo Methylierung- und der Stabilität von integrierter fremder DNA bei und geben wichtige Aufschlüsse über zelluläre epigenetische Prozesse, die von Transgenomen übernommen werden können.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language The epigenetic status of an adenovirus transgenome in hamster cells English
Translated abstract:	Abstract Language An essential part of mammalian genomes is made up of repetitive elements and other integrated foreign DNA, e.g. viral retrotransposons. The integration of foreign DNA into cellular genomes, either naturally occurring or artificially achieved, can alter the methylation and transcription of the integrated and the host cell DNA, even in regions remote from the insertion site. Alterations of methylation patterns also play a major role in many biological fields, e.g. in embryonic development and cancer formation. In this study we investigated the methylation status, the transcription profile and the nucleosome structure as well as histone modifications of integrated DNA in the human Adenovirus-type-12-(Ad12)-transformed cell lines T637 and TR12. Cell line T637 was generated by infection of non-permissive BHK21 hamster cells with Ad12. T637 cells carry about 15 copies of Ad12 DNA integrated at a single site in their genomes. During continuous culturing several morphological revertants arose spontaneously, like the cell line TR12 which had lost major parts of the Ad12-transgenome. Within this study TR12 cells were found to retain only one complete adenoviral copy plus a 3.9 kbp fragment of a second copy, derived from the right terminus of Ad12 which abuts the left end of the full length copy in an inverted fashion. We also investigated the methylation patterns of all 1634 CpG dinucleotides harboured by the Ad12-transgenome in cell line TR12, using the bisulfite protocol of genomic sequencing. Over 85% of the CpGs show a fully methylated status. About half of the 200 un- or partly unmethylated CpGs are located at both ends of the viral integrate, the other half spreads over the strongly methylated inner part of the integrate. This work proved that the adenoviral transgenomes in cell lines T637 and TR12 are organized in nucleosomes. An open chromatin structure at the insertion site is known to be an important precondition of foreign DNA integration and could also be confirmed in cell lines T637 and TR12 within this study. The results also suggest a function of histone H4 trimethylation at lysine 20 during recognition or repair of DNA double-strand breaks, as it was found exclusively accumulated at both ends of the Ad12-transgenome. In addition, this work could show that the level of transcription of the integrated viral genes depends on the degree of methylation in the corresponding promoter regions. Substantial transcription could only be detected from the un- or hypomethylated E4 promoter in cell lines T637 and TR12 as well as from the E1A- and E1B region in cell line T637. But interestingly, even the completely methylated promoters, like the MLP, were found to be compatible with low levels of transcription. This work reveals for the first time a detailed methylation pattern of an integrated adenoviral transgenome and presents evidence that Ad12-transgenomes underlie the same epigenetic regulations through DNA- and histone-modifications as the host genomes. Therefore these results contribute to a better understanding of the de novo methylation and the stability of integrated foreign DNA and shed light on the cellular epigenetic processes transgenomes can adopt. English
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Hochstein, Norbert norbert.hochstein@viro.med.uni-erlangen.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-19867
Date:	2006
Language:	German
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Biology > Institute for Genetics
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Epigenetik , DNA-Methylierung , Histon-Modifikationen , Adenovirus Typ 12 , Transgenom German Epigenetics , DNA methylation , Histone modifications , Adenovirus type 12 , Transgenome English
Date of oral exam:	8 February 2007
Referee:	Name Academic Title Doerfler, Walter Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/1986