Universität zu Köln

Vivekananthan, Nagarajavel (2007). H-NS mediated repression of the Escherichia coli bgl and proU operons. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

The histone-like nucleoid structuring protein H-NS is important in the organization of the bacterial chromosome and in global gene regulation in response to environmental stimuli and stress conditions. In Enterobacteriaceae such as Escherichia coli H-NS represses ~5 percent of all genes. Repression by H-NS is presumably mediated by binding of H-NS next to a promoter, and the formation of extended nucleoprotein complex, which inhibits transcription initiation. Although the specificity of binding of H-NS to DNA is low (it binds weakly specific to AT-rich curved DNA), some loci are very specifically repressed by H-NS including the E. coli bgl and proU operons. In both of these systems, upstream and downstream regulatory elements are required for efficient repression. In bgl H-NS binds 600 to 700 bp downstream to the promoter and in proU it binds 150 to 300 bp downstream. The analysis done here suggests that repression of proU and bgl by binding of H-NS to upstream and downstream regulatory elements is cooperative. Furthermore, it was shown that in the absence of the upstream regulatory element (URE), repression by H-NS binding to the downstream regulatory element (DRE) depends on the transcription rate. Termination factor Rho and co-transcriptional translation, which both modulate the transcription rate, were shown to also affect repression by H-NS via the DRE. Further experiments excluded, that H-NS acts as a roadblock to the transcribing RNA polymerase. In the bgl operon H-NS represses transcription elongation merely 2-fold and in proU it has no effect on elongation. These experiments include CAA-footprinting of stalled RNA polymerase transcription elongation complexes, Northern analysis, and a dual reporter gene system with the bgl and proU DRE, respectively, inserted in between uidA (?-glucuronidase) and lacZ (?galactosidase). In addition, the analysis of structural components in bgl revealed an intrinsic transcription pause site located in between the promoter and the bgl-DRE. However, the deletion of the pause did not affect repression. Additional deletion analyses suggest that the DNA segment upstream of the bgl-DRE is important for repression. The data shown here and ongoing experiments suggest that binding of H-NS to the DRE inhibits transcription initiation at the bgl and proU promoter, respectively. Possibly, H-NS bound to the DRE traps a DNA segment located upstream of the promoter resulting in DNA looping and repression of transcription initiation. Furthermore, the present work highlights the significance of the transcription rate and the process of transcription elongation in the modulation of H-NS mediated repression. Presumably, an increase in the transcription rate de-stabilizes the repressing complex formed by H-NS and thus causes full expression.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language H-NS vermittelte Repression des bgl und des proU Operons in Escherichia coli German
Translated abstract:	Abstract Language Das Protein H-NS ist für die Organisation des bakteriellen Chromosoms und die globale Genregulation bei der Antwort auf Stimuli der Umgebung und auf Stress wichtig. In Enterobacteriaceae wie Escherichia coli reprimiert H-NS ~5% aller Gene. Die Repression durch H-NS erfolgt durch Binding von H-NS in der Nähe eines Promotors und der Bildung eines ausgedehnten Nukleoproteinkomplexes, der die Transkriptionsinitiation hemmt. Die DNA-Bindespezifität von H-NS ist gering (H-NS bindet präferentiell AT-reiche gekrümmte DNA), dennoch werden einige Loci sehr spezifisch durch H-NS reprimiert. Beispiele sind das E. coli bgl und proU Operon. In beiden Loci, sind den Promotor flankierende regulatorische Elemente (upstream and downstream regulatory elements, URE bzw DRE) für die Repression notwendig. Im bgl-Locus bindet H-NS 600 bis 700 bp unterhalb des Promotors und in proU bindet H-NS 150 bis 300 bp unterhalb. Ergebnisse dieser Arbeit belegen, dass die Repression von proU und bgl durch die Bindung an URE und DRE kooperativ ist. Weiterhin wurde gezeigt, dass die Repression durch Bindung von H-NS an das DRE von der Transkriptionsrate abhängt und durch den Transkriptionsterminationsfaktor Rho sowie die ko-transcriptionelle Translation beeinflusst wird. Rho und die Translation können die Transkriptionselongationsrate modulieren. Aufgrund weiterer Experimente konnte ausgeschlossen werden, dass H-NS als Prellbock ('roadblock') für die transkribierende RNA-Polymerase wirkt. Im bgl Operon vermindert H-NS die Transkriptionselongation nur 2-fach und in proU hat H-NS keinen Effekt auf die Elongation. Diese Experimente schließen CAA-Footprinting pausierender RNA-Polymerase-Transkriptionselongations-Komplexe, Northern Analysen, und Expressionsanalysen mit Hilfe eines Zwei-Reporter-Gen-Systems ein. In letzterem wurde das bgl- bzw. proU-DRE zwischen das uidA (?-Glucuronidase) Gen und dem lacZ (?Galactosidase) Gen eingefügt. Weitere Experimente zur Analyse des bgl-DRE und umliegender Sequenzabschnitte zeigten, dass zwischen bgl-Promotor und H-NS Bindestelle eine intrinsische Pausenstelle für die Transkription kartiert. Die Deletion dieser Stelle hatte keinen Effekt auf die Repression von bgl durch H-NS. Jedoch ist der DNA-Abschnitt zwischen bgl-Promotor und bgl-DRE für die Repression wichtig. Die Daten dieser Arbeit und laufende Experimente im Labor zeigen, dass bei Bindung von H-NS an das DRE die Transkriptionsinitiation am bgl und am proU-Promotor gehemmt wird. Vermutlich führt die Bindung von H-NS an das DRE zur Bildung eines reprimierenden Nukleoproteinkomplexes, der einen DNA-Abschnitt oberhalb des Promotors mit einschließt. Die so induzierte DNA-Schleifenbildung (DNA-Loop) führt zur Repression der Transkriptionsinitiation. Weiterhin belegt diese Arbeit die Bedeutung des Transkriptionsprozesses an sich, also der Transkriptions-Initiation und der Elongation, für die Effizienz der Repression durch H-NS. Eine effiziente Repression erfolgt nur bei geringer Transkriptionsrate, während bei einer Erhöhung der Transkriptionsrate der durch H-NS gebildete reprimierende Komplex vermutlich destabilisiert wird und die Loci maximal exprimiert werden. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Vivekananthan, Nagarajavel aei60@uni-koeln.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-19967
Date:	2007
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Biology > Institute for Genetics
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language bgl, prou, E.coli. H-NS, Genregulation German bgl, prou, E.coli. H-NS, gene regulation English
Date of oral exam:	8 February 2007
Referee:	Name Academic Title Schnetz, Karin Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/1996