Universität zu Köln

Singh, Rajesh Kumar (2007). Characterization of the Ubiquitin/Nedd8 E3 ligase activity of the Mdm2/MdmX complex. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

The RING finger proteins Mdm2 and MdmX share significant structural similarity with each other and are major antagonists of the tumor suppressor protein p53. Mdm2 is a member of the RING finger family of E3 ligases and targets p53 for ubiquitination and degradation by the 26S proteasome system. Unlike Mdm2, MdmX does not have appreciable E3 ligase activity and, hence, does not induce p53 degradation on its own. However, our group previously reported that MdmX enhances the E3 ligase activity of Mdm2 in vitro. To obtain insight into the mechanism by which MdmX enhances the E3 ligase activity of Mdm2, a mutational analysis of the RING finger domains of Mdm2 and MdmX was performed. We identified several residues within the RING finger domain of Mdm2 that are essential for its E3 ligase activity. Mutation of some of these residues impairs the ability of Mdm2 to interact with itself or with MdmX indicating that oligomerization is required for Mdm2 to function as an E3 ligase. Mutation of other residues does not detectably interfere with the ability of Mdm2 to interact with itself or with MdmX. However, the ability of these mutants to interact with the ubiquitin conjugating enzyme UbcH5b is impaired. Interestingly, MdmX rescues the E3 ligase activity of the latter Mdm2 mutants, both in vitro and within cells indicating that Mdm2/MdmX hetero-oligomers can function as an E3 ligase for p53 within cells. Furthermore, we present evidence that Mdm2/MdmX hetero-oligomeric complexes not only function as ubiquitin E3 ligases for p53 but also facilitate modification of p53 with the ubiquitin-like molecule Nedd8. Moreover, all the Mdm2 mutants impaired for their ubiquitin ligase activity are also impaired for their Nedd8 ligase activity and some of them are rescued in their activity by MdmX. This suggests that Mdm2 employs similar molecular mechanisms to transfer both ubiquitin and Nedd8 to p53. In addition, we show that ubiquitin and Nedd8 can be attached to the same p53 molecule indicating that ubiquitin and Nedd8 may form mixed chains within cells. Finally, using several mutants of ubiquitin and Nedd8, we present evidence that Nedd8, when attached to ubiquitin, may function as chain terminator in cells.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language Charakterisierung der Ubiqutin/Nedd8 E3 Ligaseaktivitaet des Mdm2/MdmX Komplexes German
Translated abstract:	Abstract Language Die RING-Finger Proteine Mdm2 und MdmX zeigen große strukturelle Ähnlichkeiten zueinander und sind hauptsächliche Antagonisten des Tumorsupressorproteins p53. Mdm2 gehört zu der Familie der RING-Finger E3 Ligasen und ist verantwortlich für die Ubiqutitinierung von p53, was zu dessen Abbau durch das 26S Proteasom führt. Im Gegensatz zu Mdm2 besitzt MdmX keine nennenswerte E3 Ligase Aktivität und kann demzufolge alleine nicht den Abbau von p53 induzieren. Allerdings konnte in unserer Gruppe kürzlich gezeigt werden, dass MdmX die E3 Ligase Aktivität von Mdm2 in vitro verstärkt. Um einen genaueren Einblick in den Mechanismus zu erlangen, durch den MdmX die E3 Ligase Aktivität von Mdm2 erhöht, wurden Mutationsanalysen der RING-Finger Domänen von Mdm2 und MdmX durchgeführt. Wir konnten einige Aminosäurereste innerhalb der RING-Finger Domäne von Mdm2 identifizieren, die für dessen E3 Ligase Aktivität essentiell sind. Die Mutationen einiger dieser Reste beeinträchtigt die Fähigkeit von Mdm2, mit sich selbst oder mit MdmX zu interagieren, was darauf hindeutet, dass die Oligomerisierung für die E3 Ligase Aktivität von Mdm2 notwendig ist. Die Mutationen anderer Aminosäurereste beeinträchtigen nicht die Interaktion von Mdm2 mit sich selbst oder mit MdmX. Allerdings ist die Fähigkeit dieser Mutanten beeinträchtigt, mit dem Ubiquitin-konjugierenden Enzym UbcH5b zu interagieren. Interessanterweise kann MdmX die Aktivität der letzteren Mdm2 Mutanten wieder herstellen, sowohl in vitro als auch in der lebenden Zelle, was darauf hindeutet, dass Mdm2/MdmX Hetero-Oligomere in der Zelle eine Funktion als E3 Ligase für p53 ausüben können. Außerdem zeigen wir, dass Mdm2/MdmX Hetero-Oligomere nicht nur als E3 Ubiquitin Ligase für p53 fungieren, sondern auch die Modifikation von p53 mit dem Ubiquitin-ähnlichen Molekül Nedd8 katalysieren. Darüber hinaus sind sämtliche Mdm2 Mutanten, die in ihrer Ubiquitin Ligase Aktivität beeinträchtigt sind auch in ihrer Nedd8 Ligase Aktivität beeinträchtigt, wovon einige Mutanten in der Anwesenheit von MdmX wieder aktiv sind. Dies lässt vermuten, dass die molekularen Mechanismen der Mdm2-abhängigen Konjugation von Ubiquitin und Nedd8 an p53 zueinander sehr ähnlich sind. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass Ubiquitin und Nedd8 an das gleiche p53 Molekül angeheftet werden können, was darauf hinweist, dass Ubiquitin und Nedd8 in der Zelle möglicherweise gemischte Ketten bilden. Schließlich konnten wir durch den Einsatz verschiedener Ubiquitin- und Nedd8 Mutanten Hinweise erhalten, dass Nedd8, wenn es an Ubiquitin angeheftet wird, als Ketten-Terminator dienen könnte. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Singh, Rajesh Kumar aei72@uni-koeln.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-19976
Date:	2007
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Medicine > Biochemie > Institut I für Biochemie
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Ubiquitin , Nedd8 , Mdm2/MdmX German Ubiquitin , Nedd8 , Mdm2/MdmX English
Date of oral exam:	14 February 2007
Referee:	Name Academic Title Paulsson, Mats Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/1997