Universität zu Köln

Konijn, Hugo P. P. (2006). Analysing the role of GIGANTEA in flowering-time regulation and light signalling of Arabidopsis. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Many plants flower in response to environmental cues. Of particular significance in many plants species is initiation of flowering in response to seasonal changes in day length. An internal timing mechanism called the circadian clock enables measurement of daylength (a process called photoperiodism). As daylength changes throughout the year, photoperiodic control of flowering allows plants to develop flowers and reproduce in the appropriate season. Arabidopsis thaliana has become the species of choice in which to study the molecular-genetics of flowering-time control. This species is a facultative long-day plant that flowers much earlier under long days (LD, 16 hours light) than under short days (SD, 8 hours light); however the flowering time is intermediate if the period of light is between these extremes. A severe late flowering phenotype is caused by mutations in the GIGANTEA (GI) gene. This phenotype is at least in part caused by reducing the expression of the flowering-time gene CONSTANS (CO) and thereby delaying the time of flowering under long days. Apart from these effects, the loss-of-function gi mutant also shows shortened circadian rhythms in the expression of circadian controlled genes and lowers the expression of CCA1 and LHY, two genes thought to be closely related to the circadian clock. Additionally, mutations in GI impair the transduction of the red light signal from the photoreceptor phytochrome B. GI is a single copy gene in Arabidopsis and encodes a nuclear protein of 1173 amino acids that is highly conserved in seed plants, but no homologous proteins have been found outside the plant kingdom. The biochemical function of GI is unknown, it is expressed widely throughout the plant and its transcription shows a circadian rhythm with a peak in mRNA abundance 8 till 10 hours after dawn. The timing and duration of this peak is influenced by daylength. I addressed how GI regulates flowering time using three experimental approaches. By exploiting the yeast two hybrid system I screened for proteins interacting with GI from two libraries (total and apex from Arabidopsis). This identified 52 putative interacting proteins of which we selected 15 for further analysis. These 15 proteins were further tested for interaction with the C-terminal domain of GI, which is thought to be involved in flowering. One protein, ATA20, showed a strong interaction and 4 others (CSN6b, a CHD protein-like, a member of the TCP-family and GIP14, a ZZ-finger domain family protein) weaker interactions. Recent results demonstrated that the overexpression of GIP14 caused an elongated hypocotyl phenotype under red-light, suggesting that red-light perception was impaired. This is a similar phenotype to gi mutant plants and suggests that GIP14 might act as a negative regulator of GI protein function. To test the detailed spatial pattern of GI expression, a fusion of the GI promoter to the GUS marker gene was constructed (GI::GUS) and introduced into plants. Staining of whole seedlings, stem and leaves detected GI::GUS expression in young leaves and in the vascular tissue of the root, hypocotyl, cotelydons and leaves. Expression was also detected in the meristem of the root and shoot. This result demonstrated that GI is expressed widely in plants. To test in which tissues GI acts to regulate flowering, region specific promoters were used to misexpress GI in the gi-3 mutant. These experiments showed that expressing GI in the phloem companion cells rescues the late-flowering gi-3 mutant. Additionally, a genetic screen was performed to identify genes related to GI in function. GI increases the expression of LHY and CCA1 and the proteins encoded by these genes repress GI expression. Mutations in GI also suppress the early flowering phenotype of lhy-11 cca1-1 double mutants. An EMS mutagenesis was carried out with the lhy11cca1-1 double mutant and several late-flowering individuals were found under SD. The late flowering slc18 mutation was chosen for further study. Data on flowering-time and expression of GI, CO and FT show its significance in the flowering pathway. slc18 was mapped by using 1700 late flowering F2 plants and located to an interval of 114 kb on the lower arm of chromosome 3. This region contains no genes with a known function in flowering-time control, suggesting that SLC18 encodes a new floral regulator. The corresponding mutation will be finally identified by comparing the DNA sequence of genes in the region between the mutant and wild-type, and by complementation approaches.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated abstract:	Abstract Language Die Induktion der Blütenbildung bei Pflanzen wird durch Umwelteinflüsse gesteuert. Ein sehr bedeutender Faktor für die Blühinduktion ist die Tageslänge, die sich in Abhängigkeit von der Jahreszeit ändert. Die Pflanze misst die Tageslänge durch einen internen Zeitgeber, besser bekannt unter Circadian Clock und bestimmt somit die optimale Jahreszeit zur Blütenbildung und Fortpflanzung. Arabidopsis thaliana ist die Modelpflanze für die Erforschung der molekularbiologischen Regulation der Blühinduktion. Da die Bildung der Blüte im Langtag gefördert wird, Arabidopsis aber auch im Kurztag blüht, spricht man von einer fakultativen Langtagpflanze. Pflanzen, die eine Mutation im Gen GIGANTEA aufweisen, haben einen Defekt in der Wahrnehmung der Tageslänge. Mutationen in GI verzögern die Blühinduktion im Langtag, wohingegen sie nur einen geringen Effekt unter Kurztag-Bedingungen haben. Dieser Phänotyp ist teilweise der Reduzierung der Expression des Blühzeitpunktgens CONSTANS (CO) zuzuschreiben. Zudem verursacht die Mutation im GI Gen einen verkürzten Rhythmus in der Expression von CCA1 and LHY, zwei Genen, die in der Circadian Clock involviert sind. In gi Mutanten ist der Rotlichtsignalweg ebenfalls gestört, was zu verlängerten Hypokotylen führt. GI existiert nur einmal im Arabidopsis-Genom und codiert ein 1173 Aminosäuren langes Kernprotein. Die Sequenz des pflanzenspezifischen Proteins ist im Pflanzenreich stark konserviert. Die biochemische Funktion von GI ist bisher unbekannt. Die GI-Expression unterliegt zyklischen Schwankungen im circadianen Rhythmus mit einem Maximum etwa 8 bis 10 Stunden nach Sonnenaufgang. Dieser Rhythmus wird in Abhängigkeit von der Tageslänge reguliert. Die Rolle von GI in der Regulation der Blüheninduktion wurde durch drei experimentelle Ansätze untersucht. Bei Untersuchungen mit dem Zweihybrid-System der Hefe wurden 52 Proteine als mögliche Interaktionspartner von GI identifiziert. 15 Proteine wurden weiterhin auf Interaktion mit der für die Blühinduktion wichtigen C-terminalen Domäne von GI getestet. Das Protein ATA20 zeigte starke Interaktion mit GI, während 4 andere Proteine, unter anderem GIP14, schwächere Interaktion zeigten. Studien zeigten dass die Überexpression von GIP14 zu einer Verlängerung des Hypokotyls im Rotlicht führte. Dieser Phänotyp ähnelt dem von gi-Pflanzen, was vermuten lässt dass GIP14 möglicherweise ein negative Regulator des GI Proteins ist. Um das Expressionsmuster von GI zu analysieren wurde ein Fusionskonstrukt zwischen dem GI-Promotor und dem Reportergen GUS in Pflanzen transformiert. Die Expression von GUS wurde in jungen Blättern und den Leitgefäßen von Wurzeln, Hypokotyl, Kotyledonen und älteren Blättern nachgewiesen. Ebenfalls konnte GUS Expression in den Meristemen von Wurzel und Spross detektiert werden. Dies zeigt, dass GI in vielen Pflanzengeweben expremiert wird. Da GI mehrere Funktionen hat, wurde durch Missexpression von GI untersucht, in welchen Geweben GI die Blühinduktion kontrolliert. Dies zeigte dass die Expression von GI in die Leitgefäße den spätblühenden Phänotyp von gi-Pflanzen aufheben kann. Zusätzlich wurde ein genetischer Screen durchgeführt, um Gene zu identifizieren, deren Funktion GI ähnelt. Es wurde nach Mutanten gesucht, die wie gi den frühblühenden Phänotyp der lhy-11cca1-1 Doppelmutante im Kurztag unterdrücken. Die slc18 Mutation konnte mit Hilfe von 1700 F2-Hybriden auf eine Region von 126 kb auf dem unteren Arm von Chromosom 3 lokalisiert werden. Dieser Bereich enthält keine Gene, denen bisher einen Funktion im Blühinduktion zu geordnet werde kann. Bei SLC18 handelt es sich möglicherweise um einen neuen Blühzeitpunktregulator. Der Blühzeitpunkt von slc18-Pflanzen und die Expression der Gene GI, CO und FT wurden analisiert. Die Mutation soll durch Sequenzierung identifiziert werden. Diese Studie beinhaltet eine detaillierte Expressionsanalyse von GI, identifiziert sowohl GI interagierende Proteine als auch Gene, deren Funktionen mit GI ähnlich sind. Dadurch werden neue Ansätze zum Verständnis der Funktion von GI gegeben. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Konijn, Hugo P. P. hppkonijn@hotmail.com UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-20283
Date:	2006
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Außeruniversitäre Forschungseinrichtungen > MPI for Plant Breeding Research
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language Arabidopsis, Blühinduktion, Blühzeit, GIGANTEA German Arabidopsis, flowering-time, GIGANTEA, photoperiod English
Date of oral exam:	8 February 2007
Referee:	Name Academic Title Coupland, George Prof.Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/2028