Reconstitution of mammalian m-AAA protease complexes with variable subunit composition in yeast mitochondria

Koppen, Mirko (2007). Reconstitution of mammalian m-AAA protease complexes with variable subunit composition in yeast mitochondria. PhD thesis, Universität zu Köln. Open Access

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Abstract

The m-AAA protease, an ATP-dependent proteolytic complex in the mitochondrial inner membrane, controls protein quality and regulates ribosome assembly within mitochondria. Mutations in the human m-AAA protease subunit paraplegin cause hereditary spastic paraplegia (HSP) characterised by cell-specific axonal degeneration which is also observed in a paraplegin-deficient mouse model. It has been proposed that paraplegin mediates proteolytic processing of OPA1 which is essential for mitochondrial morphology and linked to dominant optic atrophy, another neurodegenerative disease in humans. Paraplegin assembles with homologous Afg3l2 subunits into hetero-oligomeric complexes, but the consequences of a loss of paraplegin for m-AAA protease assembly and function remain unclear. Moreover, a third putative m-AAA protease subunit, termed Afg3l1, is expressed in mice but its role for m-AAA protease activity has not been determined. The assembly status of human AFG3L2 was monitored in paraplegin-deficient mitochondria from human HSP cells revealing the existence of a homo-oligomeric AFG3L2 complex which was also formed upon heterologous expression in yeast. This AFG3L2 complex is proteolytically active as it could substitute for the yeast m-AAA protease. In related complementation studies in yeast, murine m-AAA protease subunits were found to assemble into several proteolytic complexes with variable subunit composition in the mitochondrial inner membrane. Homo-oligomeric Afg3l1 and Afg3l2 complexes and hetero-oligomeric complexes of both proteins with paraplegin could be identified. Afg3l1 was established as a bona fide subunit of m-AAA proteases with proteolytic activity. All assemblies have conserved and overlapping substrate specificities as they were able to maintain mitochondrial housekeeping functions in yeast. These results suggest that the lack of paraplegin does not lead to a complete loss of m-AAA protease activity in affected mitochondria. Instead, m-AAA protease complexes with a different subunit composition could be formed which may substitute for paraplegin-containing m-AAA proteases. First evidence for different substrate specificities of m-AAA proteases differing in their subunit composition was obtained by reconstitution of OPA1 cleavage in yeast cells harbouring different mammalian m-AAA protease complexes. The efficiency of OPA1 processing was dependent on the subunit composition of mammalian m-AAA proteases. Homo-oligomeric complexes composed of murine Afg3l1, Afg3l2, or human AFG3L2 cleaved OPA1 with higher efficiency than hetero-oligomeric complexes containing paraplegin. This also confirms OPA1 as a novel potential substrate of the m-AAA protease. Taken together, these findings reveal an unexpected variety of mammalian m-AAA proteases in the inner mitochondrial membrane and may help to understand the pathogenesis and tissue-specificity of HSP due to a loss of paraplegin.

Item Type:

Thesis (PhD thesis)

Translated title:

Title	Language
Rekonstitution von Säugetier-m-AAA-Protease-Komplexen mit variabler Untereinheiten-Zusammensetzung in Hefemitochondrien	German

Translated abstract:

Abstract

Language

Die m-AAA-Protease ist ein ATP-abhängiger proteolytischer Komplex in der inneren Mitochondrienmembran, der eine wichtige Rolle bei der Qualitätskontrolle mitochondrialer Proteine und bei der Regulation der Ribosomen-Assemblierung spielt. Mutationen in Paraplegin, einer Untereinheit der humanen m-AAA-Protease, führen zu hereditärer spastischer Paraplegie (HSP). Diese Krankheit ist durch eine zellspezifische Degeneration von Axonen gekennzeichnet, die auch in Paraplegin-defizienten Mäusen auftritt. Es wird vermutet, dass Paraplegin die proteolytische Prozessierung von OPA1 vermittelt. OPA1 ist für die Aufrechterhaltung der mitochondrialen Morphologie essentiell und wird mit dominanter optischer Atrophie, einer weiteren neurodegenerativen Erkrankung, in Verbindung gebracht. Paraplegin bildet zusammen mit homologen Afg3l2-Untereinheiten einen heterooligomeren Proteinkomplex. Die Auswirkungen eines Verlustes von Paraplegin auf die Assemblierung und Funktion der m-AAA-Protease sind jedoch unklar. Des Weiteren wird eine dritte mutmaßliche Untereinheit der m-AAA-Protease, Afg3l1, in Mäusen exprimiert, aber ihre Rolle für die Aktivität der m-AAA-Protease ist noch nicht bestimmt worden. Der Assemblierungszustand von humanem AFG3L2 wurde in Paraplegin-defizienten Mitochondrien aus humanen HSP-Zellen untersucht. Dadurch konnte die Existenz eines homooligomeren AFG3L2-Komplexes nachgewiesen werden, der auch bei heterologer Expression in Hefe gebildet wurde. Dieser AFG3L2-Komplex ist proteolytisch aktiv, da er die m-AAA-Protease der Hefe ersetzen konnte. Weitere Komplementationsstudien in der Hefe ergaben, dass die m-AAA-Protease-Untereinheiten der Maus in der inneren Mitochondrien¬membran verschiedene proteolytische Komplexe mit unterschiedlicher Zusammensetzung bilden. Homooligomere Afg3l1- und Afg3l2-Komplexe sowie heterooligomere Komplexe beider Proteine zusammen mit Paraplegin konnten identifiziert werden. Afg3l1 stellt somit eine echte Untereinheit von m-AAA-Proteasen mit proteolytischer Aktivität dar. Alle Komplexe weisen konservierte und überlappende Substratspezifitäten auf, da sie grundlegende mitochondriale Funktionen aufrechterhalten konnten. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass die Abwesenheit von Paraplegin nicht zu einem vollständigen Verlust der m-AAA-Protease-Aktivität in betroffenen Mitochondrien führt. Stattdessen könnten m-AAA-Proteasen mit unterschiedlicher Untereinheiten-Zusammensetzung gebildet werden und m-AAA-Proteasen mit Paraplegin-Beteiligung ersetzen. Durch die Rekonstitution der OPA1-Prozessierung in Hefezellen, die verschiedene m-AAA-Protease-Komplexe aus Säugetieren enthielten, konnten erste Hinweise für unterschiedliche Substratspezifitäten von m-AAA-Proteasen mit unterschiedlicher Zusammensetzung erhalten werden. Die Effizienz der OPA1-Prozessierung war abhängig von der Zusammensetzung der Untereinheiten der Säugetier-m-AAA-Proteasen. Homooligomere Komplexe bestehend aus murinem Afg3l1, Afg3l2 oder humanem AFG3L2 prozessierten OPA1 mit höherer Effizienz als heterooligomere Komplexe, die Paraplegin enthielten. Diese Ergebnisse bestätigen, dass OPA1 ein weiteres potentielles Substrat der m-AAA-Protease darstellt. Die Befunde dieser Arbeit offenbaren eine unerwartete Vielfalt an m-AAA-Proteasen in der inneren Mitochondrienmembran von Säugetieren und könnten dazu beitragen, die Pathogenese und Gewebespezifität von HSP zu verstehen.

German

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