Universität zu Köln

Ramachandran, Vimal (2007). Defining the residues governing the mitotic destruction of Drosophila cyclin A. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Mitotic destruction of cyclin A has remained enigmatic ever since it was discovered. Regulation of cyclin A proteolysis appears to be different from that of other mitotic cyclins in diverse species. Despite being substrates of the same destruction machinery - the E3 ligase called Anaphase Promoting Complex/Cyclosome (APC/C) - the proteolysis of cyclin A concludes before that of the B-type cyclins and other crucial substrates like securin. Moreover cyclin B and securin, but not cyclin A, gets stabilized upon activation of the spindle assembly checkpoint, which is a surveillance mechanism that inhibits the APC/C. Somehow, APC/C activity towards cyclin A escapes checkpoint control. Defining the cyclin A destruction signals is paramount for solving this riddle. Unfortunately, in spite of years of research, the cyclin A degradation signal remains ill-defined and poorly characterized. A single and simple destruction box (D-box) motif is responsible for cyclin B turnover. But the cyclin A degradation signal is much more complex. In Drosophila cyclin A (CycA), a putative D-box and another element called the KEN box have been implicated; but eliminating these do not cause stability. In order to characterize the elusive CycA destruction signals, an extensive analysis was carried out in this study. It was found that both the N- and C-terminal regions are involved in turnover, which implies a synergistic action by multiple parts of the molecule. A KEN box, a D-box and an aspartic acid at position 70 are required at the N-terminus and they make additive contributions to degradation when the checkpoint is active or inactive. From the C-terminal region, the cyclin box contributes. Single point mutations in these four elements totally abolish mitotic destruction. Very importantly, it was observed that the cyclin box mediates the spindle checkpoint bypass. The normal function of the cyclin box is to mediate Cdk1 binding, and previous studies had claimed that this interaction is essential for timely destruction. But it was found here that the cyclin box provides a function different from Cdk1 binding for turnover; most likely it presents an interaction motif for the APC/C. Furthermore, eight potential ubiquitin acceptor lysine residues surrounding the N-terminal signals were found to be preferentially used for proteolysis. Combining mutations in these lysines and the N-terminal signals caused full stability leading to mitotic arrest phenotypes. But, mutating the lysines alone only prolonged the duration of mitosis. Thus, presumably, lysines elsewhere on the protein are used when the preferred ones are absent. This apparent shift in ubiquitination is mediated by the N-terminal signals. In conclusion, this study defines the CycA destruction signals and gives an explanation for how checkpoint destruction can be accomplished.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language Definieren der aminosäure welche die mitotic Zerstörung von Drosophila cyclin A regeln German
Translated abstract:	Abstract Language Der Abbau von cyclin A ist seit der Entdeckung dieses mitotischen Cyclins rätselhaft geblieben. Obwohl es ein Substrat des Anaphase Promoting Complex/Cyclosome (APC/C) ist, der den Abbau der mitotischen cycline initiiert, wird cyclin A vor allen anderen Substrate abgebaut. Weiterhin wird der Abbau nicht durch Aktivierung des mitotischen Spindelcheckpoints blockiert, der den Eintritt in die Anaphase verhindert indem der Abbau der anderen APC/C-Substraten verhindert wird. Die Entzifferung des Abbausignals in cyclin A ist dabei das vorrangige Ziel, um dieses Verhalten von cyclin A zu verstehen. Allerdings zeigte sich, dass cyclin A keine einfache Abbausequenz, wie sie zum Beispiel bei cyclin B vorzufinden ist, besitzt. In cyclin A aus Drosophila (CycA) wurden verschiedene Elemente identifiziert, so eine D-Box und eine KEN-Box, die Inaktivierung beider Elemente führte jedoch zu keiner Stabilisierung. In der vorliegenden Arbeit wurde die Suche nach den Abbausequenzen extensiv erweitert. Dabei zeigte sich dass sowohl N- als auch C-terminale Regionen des Proteins beteiligt sind. Neben der KEN- und D-box spielt dabei auch ein Aspartat an der Position 70 eine Rolle und alle Elemente haben einen additiven Einfluss auf den Abbau. Im C-terminalen Teil konnte die cyclinbox als wichtiges Element identifiziert werden. Punktmutationen in den drei N-terminalen, sowie eine Punktmutation in der cyclinbox führten zur Stabilität in der Mitose. Von entscheidender Bedeutung ist die cyclinbox auch für den Abbau von cyclin A unter Bedingungen in denen der Spindelcheckpoint aktiv ist. Die Ergebnisse zeigen auch, dass diese Funktion der cyclinbox nicht über die konservierte Funktion der Cdk1 Bindung verläuft; wahrscheinlich ermöglicht die cyclinbox einen direkten Kontakt mit dem APC/C. Neben der Erkennung von cyclin A spielen auch bestimmte Lysinreste, die für die Ubiquitinylierung benutzt werden, eine Rolle beim Abbau von cyclin A. Es konnten acht Lysinreste, die in der Umgebung der N-terminalen Signale liegen, identifiziert werden, die präferentiell für den Abbau benutzt werden. Werden sie mutiert, kann bei der Anwesenheit eines normalen C-terminus, der Abbau jedoch weiterhin erfolgen. Es wird vermutet, dass die N-terminalen Abbausequenzen unter diesen Umständen einen guten Kontakt zum APC/C ermöglichen, so dass auch nicht präferentielle Lysinreste als Ubiquitinakzeptoren benutzt werden können. Solch ein Wechsel von präferentiellen zu anderen Ubiquitinakzeptorstellen kann anscheinend nur durch die N-terminalen Abbauerkennungssequenzen ermöglicht werden. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit die Abbausignale in CycA identifiziert werden und eine Erklärung gefunden werden, wie der Abbau bei Aktivierung des mitotischen Spindelcheckpoints möglich ist. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Ramachandran, Vimal Vimal.Ramachandran@uni-koeln.de UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-20917
Date:	2007
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences > Department of Biology > Institute for Genetics
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language cyclin A , mitosis , Drosophila , anaphase promoting complex , spindle assembly checkpoint English
Date of oral exam:	1 July 2007
Referee:	Name Academic Title Sprenger, Frank PD Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/2091