Universität zu Köln

Hübbers, Christian Ulrich (2007). Analysis of the functional consequences of p97 mutations leading to the multisystem disorder IBMPFD. PhD thesis, Universität zu Köln.

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Abstract

Mutations in the p97 (VCP, valosin containing protein) gene cause a late-onset form of autosomal dominant Inclusion Body Myopathy associated with Paget disease of the bone and Frontotemporal Dementia (IBMPFD). p97 is an ubiquitously expressed member of the AAA-ATPase family with a tripartite structure comprising an N terminal domain (Cdc48) involved in ubiquitin-binding, and two central D1- and D2 domains which hydrolyse ATP. p97 assembles into functional hexamers with a central cylinder formed by the D-domains surrounded by the N domains. p97 has been associated with a wide variety of essential cellular processes including the ubiquitin proteasome protein degradation system and along with its cofactors Udf1, Npl4, and Derlin-1 with the endoplasmic reticulum associated protein degradation (ERAD). In this work the pathological consequences of three heterozygous p97 mutations (R93C, R155H, R155C; located in the N-terminal Cdc48 domain of the p97 protein) on human striated muscle in vivo and in vitro are presented. IBMPFD skeletal muscle pathology is characterized by degenerative changes and filamentous p97- and ubiquitin-positive cytoplasmic and nuclear protein aggregates. Furthermore, mutant p97 leads to a novel form of dilatative cardiomyopathy with inclusion bodies. Pull-down experiments showed that all three p97 mutations do not affect the binding to Ufd1, Npl4, and ataxin-3. Structural analysis demonstrated that R93 and R155 are both surface-accessible residues located in the center of cavities that may enable ligand binding. The search for putative ligands to the R93 and R155 cavities resulted in the identification of cyclic sugar compounds and a sterol-like compound providing a novel link to p97 carbohydrate and sterol interactions in the complex pathology of IBMPFD. Analysis of stably transfected HEK293 cells showed a significantly decreased proteasome activity for cells overexpressing mutated R155C-p97 and a prominent upregulation of its autophagic activity. The R155C-p97 overexpressing HEK293 cells also showed a significant delay in clearing aggregates induced by proteasome inhibition. Immunoblotting of cell lysates derived from proteasome inhibited HEK293 cells and after the reactivation of its proteasomal activity pointed to a missregulation of the cholesterol homeostasis pathway in HEK293 cells overexpressing mutated R155C-p97 indicating a disrupted ERAD function caused by R155C mutated p97.

Item Type:	Thesis (PhD thesis)
Translated title:	Title Language Analyse der funktionellen Konsequenzen von p97 Mutationen, die zur Multisystemerkrankung IBMPFD führen German
Translated abstract:	Abstract Language Mutationen im p97 (VCP, valosin containing protein) Gen verursachen eine spät auftretende Form einer autosomal dominanten Einschlusskörper-Myopathie assoziiert mit der Paget-Erkrankung der Knochen und einer frontotemporalen Demenz (IBMPFD). p97 ist ein ubiquitinär exprimierter Vertreter der AAA-ATPase-Familie mit einer dreiteiligen Struktur bestehend aus einer N terminalen Domäne (Cdc48), welche in die Ubiquitin-Bindung involviert ist, und zwei zentralen D1- und D2-Domänen, welche ATP hydrolisieren. p97 lagert sich zu einem funktionalen Homohexamer zusammen, bestehend aus einem aus den D-Domänen gebildeten zentralen Zylinder, welcher von den N-Domönen umgeben wird. p97 wurde mit einer Vielzahl von essenziellen zellulären Prozessen in Verbindung gebracht, darunter das Ubiquitinin-Proteasom-Degradationssystem und einschließlich seiner Co-Faktoren Ufd1, Npl4 und Derlin-1 mit dem Endoplasmatischen Retikulum assoziierten Degradationssystem (ERAD). In dieser Arbeit wurden die pathologischen Konsequenzen von drei heterozygoten p97-Mutationen (R93C, R155H und R155C; alle lokalisiert in der N terminalen Cdc48-Domäne des p97 Proteins) anhand menschlicher quergestreifter Muskulatur in vivo und in vitro analysiert. Charakteristisch für die IBMPFD-Skelettmuskelpathologie sind degenerative Veränderungen und filamentöse p97- und Ubiquitin-positive cytoplasmatische und nukleäre Proteinaggregate. Außerdem führt mutiertes p97 zu einer neuen Form der dilatativen Kardiomyopathie mit Einschlusskörperchen. Pull-down Experimente konnten zeigen, dass alle drei p97-Mutationen keinen Effekt auf die Bindung mit Ufd1, Npl4 und Ataxin-3 haben. Strukturuntersuchungen zeigten, dass die Aminosäuren R93 und R155 frei zugänglich an der Oberfläche von p97 liegen. Beide bilden die Zentren von potentiellen Bindetaschen und könnten eine Ligandenbindung ermöglichen. Die Suche nach potentiellen Liganden für die R93 und R155 Bindetaschen ergab verschiedene zyklische Zuckerverbindungen und ein Sterol. Diese Ergebnisse eröffnen eine neue Verbindung zwischen p97 und einer Karbohydrat- und Sterol-Interaktion in der komplexen Pathologie der IBMPFD-Erkrankung. Stabil transfizierte HEK239-Zellen zeigten eine signifikante Abnahme der Proteasom-Aktivität in R155C-p97 überexprimierenden Zellen und eine deutliche Zunahme von deren Autophagie-Aktivität. Außerdem zeigten diese R155C-p97 überexprimierenden HEK293-Zellen eine deutlich verzögerte Abbauaktivität von per Proteasominhibition induzierten Proteinaggregaten. Immunoblots von Zelllysaten aus Proteasom-inhibierten HEK293-Zellen und nach anschließender Proteasomreaktivierung wiesen auf eine Fehlregulation des Cholesterol-Homöostase-Signalweges für R155C-p97 überexprimierende Zellen hin. Dies impliziert eine gestörte ERAD-Funktion, verursacht durch die R155C p97 Mutation. German
Creators:	Creators Email ORCID ORCID Put Code Hübbers, Christian Ulrich Christian@Huebbers.net UNSPECIFIED UNSPECIFIED
URN:	urn:nbn:de:hbz:38-22032
Date:	2007
Language:	English
Faculty:	Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Divisions:	Faculty of Medicine > Biochemie > Institut I für Biochemie
Subjects:	Life sciences
Uncontrolled Keywords:	Keywords Language IBMPFD , p97 , VCP , Ubiquitin German IBMPFD , p97 , VCP , Ubiquitin English
Date of oral exam:	20 November 2007
Referee:	Name Academic Title Noegel, Angelika A. Prof. Dr.
Refereed:	Yes
URI:	http://kups.ub.uni-koeln.de/id/eprint/2203